Innerzelluläre Logistik

In der Zelle sorgen sorgfältig produzierte Miniatur-Container für den Transport überlebenswichtiger Güter. Constanze Reinhard und Felix Wieland vom Biochemie-Zentrum der Universität Heidelberg beschreiben, woraus diese "Transportvesikel" bestehen, wie sie entstehen und wann sie gebildet werden. Sie erläutern, welche biochemischen Tricks vonnöten sind, um den komplexen Transportwegen in der winzigen Zelle auf die Spur zu kommen und erklären, welche Bedeutung grundlegende Erkenntnisse vom zellulären Innenleben für die Entwicklung neuer Therapien haben.

Zellen sind winzige Gebilde. 50 bis 100 von ihnen muß man hintereinanderlegen, damit sie einen Punkt mit einem Durchmesser von rund einem Millimeter ergeben und für das menschliche Auge sichtbar werden. Jede Zelle hat eine ihr ureigene, charakteristische Aufgabe: Blutzellen beispielsweise transportieren Sauerstoff, Immunzellen wehren Krankheits-erreger ab, Leberzellen versorgen den Körper mit Proteinen und anderen Stoffen, die in unserem Blut zirkulieren, Knochenzellen bauen das Skelett und Hirnzellen speichern Informationen. Aus einer Vielzahl solch spezialisierter Zellen bestehen tierische Organismen.
So klein Zellen sind, so komplex ist ihr Innenleben: Eine einzige Leberzelle enthält zum Beispiel rund 10000 verschiedene Proteine. Jedes Protein kommt durchschnittlich eine Million Mal in der Zelle vor. Das heißt, eine einzelne Zelle enthält insgesamt circa zehn Milliarden Proteinmoleküle. Schaut man sich die Proteine genauer an, erkennt man, daß es sich um lange Kettenmoleküle handelt, die aus unterschiedlichen Kombinationen von 20 verschiedenen Bausteinen, den Aminosäuren, bestehen. Die unterschiedliche Reihenfolge von Aminosäuren in der Molekülkette verleiht den Proteinen ihre einzigartigen Eigenschaften. Sie können sich zu eindeutigen räumlichen Strukturen falten, und jedes gefaltete Protein erfüllt eine besondere Aufgabe – im Innern der Zelle (intrazellulär), auf ihrer Oberfläche oder außerhalb der Zelle (extrazellulär), zum Beispiel als ein in der Blutbahn zirkulierendes Protein.
Ein großer Teil der intrazellulären Proteine ist löslich und bildet das Zellplasma. Eine äußere "Haut", die Plasmamembran, umschließt die Zelle und verhindert, daß das Zellplasma austritt. Ein weiterer erheblicher Anteil der zellulären Proteine ist nicht frei löslich, sondern fest an zelluläre Membranen gebunden. Neben der äußeren Plasmamembran gibt es im Inneren der Zelle noch eine Reihe spezialisierter Räume, die ebenfalls durch Membranen von ihrer Umgebung, dem Zellplasma, abgeschirmt sind. Diese Unterteilung der Zelle in einzelne Funktionsräume oder "Kompartimente" erlaubt es einer höheren Zelle, etwa einer menschlichen Zelle, ihre ungeheure Zahl an unterschiedlichen Stoffwechselleistungen exakt zu kontrollieren.
Nun wäre es wenig sinnvoll, wären diese Funktionsräume völlig voneinander abgeschirmt. Sie könnten dann nicht mit ihren Einzelfunktionen zur Gesamtfunktion der Zelle beitragen. Wie die unterschiedlichen Funktionsräume einer Zelle miteinander kommunizieren, ist ein Hauptgegenstand der modernen biochemischen Forschung, der "Molekularen Zellbiologie".
Damit Stoffe zwischen Funktionsräumen ausgetauscht werden können, gibt es in den Membranen Öffnungen, die nur ganz bestimmte Moleküle passieren lassen.

Türen für besondere Gäste

Eine Membran besteht aus einer Doppelschicht von Lipiden (Fetten), in die Proteine eingelagert sind. Die Membran eines Funktionsraumes gleicht einer Wand, die kontrolliert zu öffnende Türen besitzt, die nur ausgewählte Insassen und Besucher benutzen dürfen. Diese Vorrichtung genügt aber alleine nicht. Denn die Funktionsräume selbst müssen ja hergestellt werden. Das heißt, es muß eine Möglichkeit geben, auch Membranen, also "Wandteile", innerhalb der Zelle von einem Funktionsraum zu einem anderen zu bringen. Diese Aufgabe erfüllen "Transportvesikel" – membranumhüllte Bläschen mit wasserlöslichem Inhalt, etwa Ionen und lösliche Proteine. Derzeit sind drei verschiedene Typen dieser intrazellulären "Container" bekannt. Sie haben unterschiedliche Funktionen und tragen bestimmte Hüllproteine auf ihrer Oberfläche, nach denen sie benannt sind: Clathrin-umhüllte Vesikel dienen dem Transport von außen nach innen, das heißt, sie sind in der Lage, Material in die Zelle zu bringen, das zuvor an die Zelloberfläche gebunden war; die sogenannten COPI- und COPII-Vesikel (COP = coat- protein) sind für den Membranverkehr im Inneren der Zelle zuständig. Unser Labor hat sich in den letzten zehn Jahren mit der Analyse von COPI-Vesikeln beschäftigt. Wir wollen herausfinden, wie solche Vesikel aus einer Muttermembran entstehen. Die Muttermembran von COPI-Vesikeln umschließt einen intrazellulären Funktionsraum, den Golgi-Apparat. Seinen Namen hat er nach Camillo Golgi. Der italienische Pathologe und Zellbiologe entdeckte das winzige Zellorgan – die "Zellorganelle" – vor 100 Jahren und erhielt dafür den Nobelpreis für Physiologie und Medizin.
Zuerst haben wir – gemeinsam mit der Gruppe von James Rothman in New York – genügend COPI-Vesikel gereinigt, um ihre Bestandteile chemisch zu analysieren. Dazu machten wir uns Rothmans bahnbrechende Entdeckung zunutze, daß aus dem isolierten Golgi-Apparat COPI-Vesikel im Reagenzglas gebildet werden können. Während unserer Analysen stellten wir fest, daß COPI-Vesikel einfach aufgebaut sind: Ihre Hülle besteht aus einem regulierbaren Protein – es wird Arf genannt – und einem Protein-Komplex, der sieben Untereinheiten enthält und als Coatomer bezeichnet wird (für Coat Protomer = Hüllen-Vorläuferprotein). Diese Proteine sind lösliche Bestandteile des Zellplasmas, das heißt, sie müssen bei der Entstehung eines Vesikels an die Muttermembran (die Golgi-Membran) gebunden werden.

Eine außergewöhnliche Familie

Nachdem wir die Struktur des Protein-Komplexes aufgeklärt hatten, kümmerten wir uns um die Membrankomponenten der Vesikel. Wir charakterisierten einige Membranproteine der COPI- Vesikel, die einer Proteinfamilie, der "p24-Familie", angehören. Darüber hinaus machten wir die überraschende Entdeckung, daß die Membran der COPI-Vesikel eine andere Lipidzusammensetzung hat als die Muttermembran, der Golgiapparat. Dies bedeutet, daß bei der Entstehung von COPI- Vesikeln Membran-Lipide sortiert werden.
Doch zurück zu den Proteinen: Was wir nach unseren ersten Untersuchungen wußten, war, daß zur Bildung der Vesikel die beiden Hüllproteine aus dem Zellplasma an die Golgimembran gebunden werden müssen. Was wir nicht wußten, war, wie das geschieht und warum. Deshalb prüften wir, ob das Stück der vesikulären Membranproteine, das zum Zellplasma hin orientiert ist, mit den Hüllproteinen eine Bindung eingehen kann. Tatsächlich stellten wir fest, daß das Hüllprotein an synthetisch hergestellte Proteinstücke (Peptide) bindet, die dem zum Zellplasma orientierten Anteil des vesikulären Membranproteins entsprechen. Dies deutete darauf hin, daß die Hüllproteine und die Membranproteine die Maschinerie bilden, die gebraucht wird, damit COPI-Vesikel entstehen können. Wie aber beweisen, daß es tatsächlich diese – und nur diese – Komponenten sind, die ein COPI-Vesikel bilden? Zur Beweisführung verwendeten wir den sogenannten reduktionistischen Ansatz. Danach ist der Beweis erbracht, wenn es gelingt, aus den genannten Komponenten im Reagenzglas mit einer chemisch vollständig definierten Muttermembran COPI-Vesikel zu bilden.
Membranen aus chemisch definierten Lipiden herzustellen, ist eigentlich nicht schwer: Man emulgiert Lipide in Wasser – und die Membranen bilden sich von selbst. Es entstehen kleine Hohlkügelchen, "Liposomen". Wie aber kann das Proteinstück eines Membranproteins in solche Liposomen eingebaut werden? Um dies zu bewerkstelligen, bedienten wir uns eines Tricks: Wir stellten chemisch ein Lipid her, das an einem Ende das entsprechende Proteinstück (in Form eines synthetischen Peptids) enthält. Dieses "Lipopeptid" gaben wir zu dem Lipidgemisch, aus dem wir die Liposomen erzeugten. Daraufhin erhielten wir Liposomen, aus deren Lipid-Umhüllung die Proteinstücke nach außen ragten.
Jetzt hatten wir alle Teile beisammen, mit denen wir ein künstliches COPI-Vesikel aufbauen wollten: Das Arf-Protein erzeugten wir mit gentechnischen Methoden in einem Bakterium; den Hüllproteinkomplex Coatomer isolierten wir aus dem Zellplasma von Rinderhirn; als künstliche Muttermembranen dienten die Liposomen mit ihren Proteinstücken auf der Oberfläche, die Coatomer zu binden vermögen. Nun wurden alle Komponenten gemischt, für kurze Zeit bei 37 Grad stehengelassen und dann der Ansatz mit Hilfe des Elektronenmikroskops betrachtet. Ein Elektronenmikroskop kann so stark vergrößern, daß selbst sehr kleine Vesikel noch sichtbar werden. Unter geeigneten Bedingungen kann man sogar die Proteinhülle der Vesikel erkennen.
Das Elektronenmikroskop machte sichtbar, daß tatsächlich COPI-bedeckte Vesikel aus den Mutterliposomen entstanden waren. Unser über die Jahre gereiftes und in vielen experimentellen Ansätzen erarbeitetes Konzept war aufgegangen.
Nun galt es herauszufinden, ob dieser Prozeß spezifisch abläuft. Dazu mußten wir prüfen, ob unter ähnlichen (aber anderen) Bedingungen solche Vesikel nicht gebildet werden. Wir stellten deshalb Mutterliposomen her, die ein leicht verändertes Proteinstück auf ihrer Oberfläche tragen; oder wir ließen den Ansatz nicht bei 37 Grad, sondern bei null Grad stehen; oder wir benutzten Mutterliposomen, die kein Proteinstück auf ihrer Oberfläche tragen. Wir stellten fest, daß bei keiner dieser Bedingungen COPI-Vesikel entstanden, das heißt, ihre Bildung mit dem "richtigen" Proteinstück war spezifisch. Nun galt es, diese Vesikel zu reinigen und biochemisch zu charakterisieren. Die Biochemie ist ein feines Handwerk. Ein typisches biochemisches Handwerkszeug ist eine Methode, die oft verwendet wird, um Membranen voneinander zu trennen. Dazu nutzt man die Tatsache, daß verschiedene Membranen unterschiedliche Mengen an Proteinen und Lipiden besitzen und damit unterschiedliche Dichten aufweisen. Membranen mit viel Lipid und wenig Protein haben eine geringe Dichte; Membranen mit viel Protein und wenig Lipid haben eine höhere Dichte.
Wie kann man diesen Unterschied nutzen? Ganz einfach: Man läßt die Membranen wandern, bis sie an einen Ort gelangen, der ihrer Schwebedichte entspricht. Der Vorgang gleicht dem Verhalten verschiedener Holzarten im Wasser: Ein Stückchen Fichtenholz hat eine geringere Dichte als Wasser, es schwimmt oben. Ein Edelholz hat die gleiche Dichte wie Wasser: Es schwebt. Beschwert man das Edelholz mit einem Stück Blech, ist die Dichte ein klein wenig höher als die des Wassers – es wird sinken. Geben wir Zucker ins Wasser, erhöhen wir dessen Dichte: Jetzt schwimmt das Fichtenholz noch mehr obenauf; das Edelholz, das im reinen Wasser schwebte, schwimmt in der Zuckerlösung obenauf; das mit Blech beschwerte Edelholz wird möglicherweise gerade schweben.
Was wir also brauchen, um Membranen zu trennnen, sind viele verschiedene Zuckerlösungen, die verschiedene Dichten aufweisen – und zwar alle Dichten, bei denen die unterschiedlichen Membranen gerade schweben. Diese Voraussetzung erfüllt ein sogenannter Zucker-Gradient. Wir benützen eine Lösung mit wenig Zucker (beispielsweise zehn Gramm Zucker auf 0,1 Liter = zehnprozentig) und eine hochkonzentrierte, zum Beispiel 60prozentige Lösung. Mit einer geeigneten Vorrichtung lassen sich beide Lösungen gleichzeitig so mischen, daß ein sogenannter kontinuierlicher Gradient entsteht. Setzen wir nun die Lösung, die unser Membrangemisch enthält, auf den leichten Teil des Gradienten auf (Probe), passiert erst einmal gar nichts. Denn die schweren Membranen sinken aus ihrer verdünnten Lösung in den Gradienten nur sehr langsam ab – es wirkt ja nur die einfache Erdanziehungskraft. Man kann Membranen aber dazu zwingen, schneller in den Gradienten zu wandern. Dazu benützt man die Zentrifugalkraft. In einer sogenannten Ultrazentrifuge kann man Zentrifugalkräfte erzeugen, die leicht 100.000 mal so groß sind wie die Erdanziehung. Unter dieser Zentrifugalkraft wandern verschiedene Membranen in wenigen Stunden oder gar in Minuten in den Gradienten. Entspricht beispielsweise die Schwebedichte einer Membran der Dichte einer 30prozentigen Zuckerlösung, wandert sie genau bis zu der Stelle im Gradienten, wo die Zuckerkonzentration 30prozentig ist – auf keinen Fall weiter. Dies entspricht dem Verhalten des Edelholzes, das im Wasser schwebt, aber nicht sinkt. Membranen mit geringerer Schwebedichte als zehnprozentige Zuckerlösung bleiben oben – wie Fichtenholz, das auf dem Wasser schwimmt. Eine Membran mit hoher Dichte wandert weiter, aber nur solange, bis sie bei der Dichte angekommen ist, die ihrer Schwimmdichte entspricht. Ist die Zentrifugation beendet, beginnt die "Ernte": Wir stechen ein Loch in den Boden des Bechers, der die Lösung enthält, und fangen die Tropfen auf. Zuerst werden die schweren Membranen heraustropfen, dann die mittleren und darauf die leichteren.
Dieses Trennprinzip verwendeten wir, um die kleinen, proteinbedeckten Liposomen von denjenigen zu trennen, die wenig oder kein Protein enthalten. Erwartungsgemäß fanden sich die nicht verbrauchten Mutterliposomen mit viel Lipid und wenig Protein oben. Die kleinen, mit viel Protein bedeckten Vesikel wanderten wie erwartet zu einer Zuckerkonzentration höherer Dichte und konnten somit abgetrennt werden. Wie das elektronenmikroskopische Bild zeigt, handelt es sich tatsächlich um eine recht einheitliche Population proteinbedeckter Vesikel. Der Vergleich dieses Bildes mit der Abbildung des ursprünglichen Gemischs macht deutlich, daß die Anreicherung – die Reinigung – dieser Vesikel sehr effizient war.
Faszinierend war, daß die künstlichen COPI-Vesikel die gleiche Schwimmdichte zeigten wie die "echten", aus Golgi-Membranen hergestellten. Jetzt konnten wir die Proteine dieser künstlichen Vesikel leicht analysieren und stellten erfreut fest, daß sie in einem Mengenverhältnis vorkamen, das dem in authentischen Vesikeln verblüffend ähnlich war. Mit diesen Experimenten war es uns also gelungen zu beweisen, welche Komponenten die minimale Maschinerie bilden, die zur Entstehung eines COPI-Transportvesikels notwendig ist.
Welche Perspektiven bieten diese grundlegenden Erkenntnisse? Die Zelloberfläche ist nicht zufällig mit Proteinen und Lipiden gespickt; sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen: Proteine können sich gegenseitig mit großer Zuverlässigkeit erkennen, etwa während der Embryonalentwicklung, um ein Organ zu bilden. Schlägt die Erkennung fehl, kann Krebs entstehen. Andere Proteine auf der Zelloberfläche bilden Rezeptoren ("Aufnahmestationen"), die aus der Umgebung gezielt Material aufnehmen, zum Beispiel Cholesterin. Rezeptoren können auch Signale von außen aufnehmen und sie in das Innere der Zelle weiterleiten – häufig handelt es sich dabei um überlebenswichtige Informationen für Zellsysteme. Alle diese Proteine auf der Oberfläche von Zellen werden im Inneren der jeweiligen Zelle hergestellt. Und alle werden auf einer Teilstrecke ihres Weges zur Plasmamembran in COPI-Vesikeln transportiert.
Aufgrund ihrer zentralen Bedeutung für ein gesundes Zell-Leben können schon kleine Defekte bei der Bildung dieser COPI-Vesikel oder bei der Aufnahme ihrer Fracht schwerwiegende Folgen haben. Wenn zum Beispiel der LDL-Rezeptor (die Aufnahmestation für eine bestimmte Transportform des Cholesterins) nicht mehr in normaler Menge auf der Zelloberfläche vorhanden ist, führt dies zu einem gestörten Gleichgewicht des Cholesterins im Blut und damit zur gefürchteten Artherosklerose.
Auch Proteinkomponenten einiger Viren nutzen den sekretorischen Weg über COPI-Vesikel. Dies ist unerläßlich für die Vermehrung dieser Viren. Gelänge es, die Aufnahme viraler Proteine in die Vesikel gezielt zu verhindern, könnte die Virusvermehrung unterdrückt und ein Weg eröffnet werden, um neue antivirale Medikamente zu entwickeln. Voraussetzung ist, detailliert zu verstehen, wie die Vesikel im Innern der Zelle entstehen. Viele weitere Beispiele für die biomedizinische Nutzung solcher Ergebnisse der Grundlagenforschung ließen sich aufführen. Der Weg von der grundlegenden Erkenntnis zur nützlichen Anwendung ist allerdings zumeist weit. Ohne grundlegende Erkenntnis ist die rationale Entwicklung neuer Therapien jedoch überhaupt nicht möglich.

Autoren:

Dipl.-Biol. Constanze Reinhard und Prof. Dr. Felix Wieland,
Biochemie-Zentrum der Universität Heidelberg (BZH), Im Neuenheimer Feld 328, 69120 Heidelberg,
Telefon (06221) 54 41 50, e-mail: felix.wieland@urz.uni-heidelberg.de