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Postverkehr in der Zelle

Transportprozesse haben in unserem täglichen Leben große Bedeutung. Wir verschicken Briefe und Pakete, geben unsere Koffer am Flughafenschalter ab, zum automatischen Transport ans Reiseziel. Der Koffer wird mit einer Adresse versehen, und wenn wir Glück haben, kommt er am gewünschten Ort auch an. Eine umfangreiche Logistik hinter den Kulissen ist notwendig, um ein Gepäckstück von Station zu Station weiterzuleiten. Ähnliche Transportprozesse gibt es auch in jeder Zelle unseres Körpers. Proteine müssen von ihrem Syntheseort, dem Zytosol, an verschiedene Stellen innerhalb der Zelle oder aus der Zelle hinaus an verschiedene Orte im Körper verschickt werden. Bernhard Dobberstein, jetzt am Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg, entschlüsselte Teile des Zustellsystems der Zelle.

Für die Reise aus der Zelle hinaus haben Proteine große Hindernisse zu überwinden: Es gilt die Zellmembran zu durchdringen, welche die Zelle normalerweise vor Eindringlingen schützt. Auch in der Körperzelle sind Membranen zu durchqueren, die dort zahlreiche Kompartimente bilden, in denen unterschiedliche biochemische Prozesse ablaufen, wie zum Beispiel Energiegewinnung oder Müllverwertung", Exportkontrolle und Verpackung. Wie bewältigen die Körperzellen diese Schwierigkeiten? Wie sortieren sie die Proteine aus, die zum Export bestimmt sind? Die Forschung vieler Arbeitsgruppen, darunter auch meiner, hat in den letzten 20 Jahren gezeigt, daß die Zellen eine ähnliche Transportlogistik verwenden wie die Post: Das zu transportierende Gut wird mit einer "Adresse" versehen, die an verschiedenen Stationen entziffert, "decodiert" wird. Entsprechend seiner Adresse wird das Gut dann in verschiedene Transportrouten eingeschleust. Wie die Zellen ihre Proteine für den Export kennzeichnen und sie dann durch eine Membran transportieren, und auf welche Weise es uns gelang, das DZustellsystem" in der Zelle zu entschlüsseln, möchte ich im folgenden beschreiben.

Schon vor vielen Jahren war bekannt, daß jede Zelle in unserem Körper die Fähigkeit hat, bestimmte Proteine zu exportieren. Das können Botenstoffe sein, Hormone, die Informationen zwischen den Zellen übertragen, ebenso wie Antikörper, die im Blut zirkulieren und uns gegen Eindringlinge schützen, oder Verdauungsenzyme, die im Darm unsere Nahrung aufschließen. Letztere werden in Zellen der Bauchspeicheldrüse synthetisiert, in Transportbehälter, Vesikel, verpackt und bei Bedarf aus der Zelle ausgeschleust. Da die Zellen der Bauchspeicheldrüse auf die Sekretion von Proteinen spezialisiert sind, lag es nahe, in diesen Zellen den "Versand" der Proteine genauer zu untersuchen. Von bahnbrechender Bedeutung für die Untersuchung der Proteinsekretion war die Entwicklung des Elektronenmikroskops und der Ultrazentrifuge. Mit dem Elektronenmikroskop gelang es George Palade und seinen Mitarbeitern erstmals, Membranstrukturen im Inneren von Zellen sichtbar zu machen. In den Sekretzellen der Bauchspeicheldrüse fanden sie besonders ausgedehnte Membransysteme, flach aufeinanderliegende Membranen mit einer rauhen Oberfläche, "das endoplasmatische Retikulum", ER, im basalen Teil, und oben eine Ansammlung elektronendichter, runder Strukturen. Da die Sekretzellen der Bauchspeicheldrüse Dspezialisierte Exportfabriken" sind, nahmen die Untersucher an, daß die im Elektronenmikroskop sichtbaren Strukturen etwas mit dem Proteintransport zu tun haben. Um den Weg der Sekretproteine innerhalb einer Bauchspeicheldrüsenzelle zu verfolgen, boten sie den Zellen radioaktiv markierte Aminosäuren als Nahrung an. Die wurden in die Sekretproteine eingebaut. In verschiedenen Zeitabständen bestimmten Palades Mitarbeiter dann den Ort der radioaktiv markierten Proteine durch "Autoradiographie". Dabei beschichtet man Dünnschnitte von Zellen mit einer strahlungsempfindlichen Emulsion, in welcher die durch die markierten Aminosäuren ausgelösten radioaktiven Zerfälle eine Schwärzung auslösen wie bei der Belichtung eines Films. So läßt sich der Weg durch die Zelle verfolgen. Fünf bis zehn Minuten nach der "Fütterung" waren die neusynthetisierten radioaktiv markierten Proteine im rauhen endoplasmatischen Retikulum zu finden, nach etwa zehn bis 30 Minuten in den flachen Membrankompartimenten im mittleren Teil der Zelle , dem sogenannten "Golgi-Komplex", und zuletzt in den elektronendichten runden Membranstrukturen, den "Sekretgranula" im oberen Teil der Zelle. Nach etwa einer Stunde konnten die Proteine außerhalb der Zelle nachgewiesen werden. Ein biochemischer Ansatz bestätigte den intrazellulären Transportweg von Sekretproteinen. Hierbei wurde Gewebe der Bauchspeicheldrüse in einem Homogenisator, einer Art Mixer, zerkleinert und die verschiedenen Membranräume, die Organellen, mittels Ultrazentrifugation voneinander getrennt. Auch mit dieser Methode fand man neusynthetisierte Sekretproteine zuerst innerhalb der Membranräume des endoplasmatischen Retikulums und später in den runden Sekretgranula. Palade erhielt im Jahr 1974 für seine Arbeiten über den sekretorischen Weg von Proteinen den Nobelpreis für Medizin.

Ich will das Zustellsystem der Zelle noch einmal genauer nachzeichnen. Der Weg beginnt mit der Synthese eines Proteins an den Ribosomen, den "Proteinfabriken" der Zelle. Wenn ein Ribosom ein sekretorisches Protein synthetisiert, sitzt es auf der Membran des endoplasmatischen Retikulums, daher der Eindruck Drauh" im Elektronenmikroskop. Die Ribosomen binden an die Membran zum einen über eine direkte Wechselwirkung und zum anderen über den neusynthetisierten Proteinstrang, der schon während seiner Synthese in die Membran eindringt. Im Innenraum des ER, seinem "Lumen", wird der neusynthetisierte Proteinstrang von einem großen Aufgebot an Helfern, den "Chaperonen", in Empfang genommen. Sie spielen eine essentielle Rolle bei der komplizierten Faltung des linearen Proteinstrangs in seine endgültige dreidimensionale Struktur. Die korrekte Faltung ist unerläßlich für ein planmäßiges Funktionieren und unterliegt einer strikten Qualitätskontrolle. Nur Proteine, die die Kontrolle passieren, werden in Transportbehälter, Membranvesikel, verpackt und zur nächsten Station des sekretorischen Wegs, dem Golgi-Komplex, gebracht. In diesem System aus flachen, übereinanderliegenden Membranstapeln werden viele neusynthetisierte Sekretproteine durch Umlagerung und Anheftung von Zuckern modifiziert und anschließend in Sekretbehältern gesammelt und gelagert. Wenn nun Nahrung im Magen ankommt, eilen Botenstoffe zur Bauchspeicheldrüse, die bewirken, daß die Sekretbehälter mit der Plasmamembran fusionieren und die gespeicherten Sekretproteine ausgeschüttet werden.

Die Grundzüge des sekretorischen Wegs waren also mit den Arbeiten von Palade und seinen Mitarbeitern Ende der 70er Jahre bekannt. Offen blieb die Frage, wie die Zelle festlegt, welche Proteine für den Export bestimmt sind und welche in der Zelle verbleiben sollen. Viele Hypothesen wurden aufgestellt, darunter auch die 1971 von Günter Blobel, Rockefeller University, New York, formulierte Signalhypothese, die besagt, daß Sekretproteine selbst an ihrem Anfang eine Signalsequenz, eine Art Postleitzahl besitzen müßten, die von einem Rezeptor in der Membran des endoplasmatischen Retikulums erkannt würde. Nur wenn ein Protein so als echtes Sekretprotein charakterisiert wäre, sei der Weg durch die Membran frei. Proteine, die in der Zelle verbleiben, sollten keine Signalsequenz besitzen und Proteine, die in andere Zellorganellen transportiert werden, müßten eine Signalsequenz mit anderen Eigenschaften als die der sekretorischen Proteine besitzen. Ich arbeitete zu dieser Zeit als Postdoc im Labor von Blobel und war von der Signalhypothese begeistert. Es war spannend, sich vorzustellen, daß eine Zelle Proteine nach einem ähnlichen Sortierprinzip exportiert wie die Post Briefe verschickt. Doch wie konnten wir experimentell nachweisen, ob diese Hypothese richtig oder falsch war? Wir entschlossen uns, den Transport eines Proteins durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums an isolierten Membranen im Reagenzgefäß nachzuvollziehen. Aus der Bauchspeicheldrüse eines Versuchstiers präparierten wir die rauhen Membranen des endoplasmatischen Retikulums. Wenn man das Gewebe homogenisiert, zerbrechen die flachen Membranschichten, und dank der Lipide in den Membranstücken bilden sich geschlossene, runde Behälter, DMikrosomen", welche die Ribosomen auf der äußeren Oberfläche tragen. Daran haben wir getestet, ob auch ein fremdes Sekretprotein, zum Beispiel ein Antikörpermolekül, durch die mikrosomale Membran transportiert werden kann und wie sich Globin verhalten würde, ein intrazelluläres, zytosolisches Protein der roten Blutkörperchen. Dazu synthetisierten wir die radioaktiv markierte Antikörperkette und Globin in An- und Abwesenheit von Mikrosomen in einem Reagenzglas. Um herauszufinden, ob das sekretorische Protein in der Tat die Membran durchquert hat und in die Membranvesikel gelangt war, setzten wir dem Ansatz ein Gemisch von proteinabbauenden Enzymen zu, Proteasen. Wir wußten, daß frei zugängliche, nicht in abgeschlossenen Organellen vorliegende Proteine dadurch nahezu vollständig abgebaut würden, während die in die Mikrosomen transportierten durch die umgebende Membran vor dem Abbau geschützten Proteine intakt bleiben sollten. Das Ergebnis dieses Experiments war eindeutig: Nur das sekretorische Protein, die Antikörperkette, war gegenüber den abbauenden Enzymen geschützt, also durch die Membran in die Mikrosomen transportiert worden. Globin dagegen, das zytosolische Protein, konnte von den Proteasen abgebaut werden, da es offensichtlich nicht in die Mikrosomen gelangt war. Ein Transport erfolgte jedoch nur, wenn die Membranen während der Synthese des Proteins anwesend waren, nicht aber, wenn das fertige Protein erst später mit Mikrosomen zusammengebracht wurde. Beim Transport durch die Membran wurde ein kurzer Abschnitt der Aminosäurekette des sekretorischen Proteins abgespalten. Später zeigte sich, daß in diesem Teilstück die Signalsequenz enthalten ist, sozusagen die Postleitzahl. Signalsequenzen sind in der Zwischenzeit für eine Vielzahl sekretorischer Proteine identifiziert worden. Ihre DPostleitzahlen" bestehen aus kurzen Abschnitten, etwa 15 bis 40 Aminosäuren lang, die alle eine zentrale Region hydrophober, das heißt wasserabweisender Aminosäuren besitzen. Nachdem man solche Signalsequenzen zunächst in tierischen Zellen gefunden hatte, konnten sie auch in bakteriellen Sekretproteinen nachgewiesen werden. Auch Bakterien wählen demnach die Proteine für den Export durch eine Signalsequenz aus. Viele Signale sind sogar zwischen bakteriellen und tierischen Proteinen austauschbar. Wenn man eine solche Signalsequenz vor ein Protein koppelt, das normalerweise im Zytoplasma verbleibt, kann sogar dieses Protein aus der Zelle ausgeschleust werden. Hier drängt sich der Vergleich zum Zustellsystem der Post auf, die sich bei der Lieferung von Briefen und Paketen an Postleitzahlen orientiert und alles transportiert, wenn es richtig adressiert ist und wir für den Transport bezahlen. Übrigens "bezahlt" auch die Zelle, sie muß Energie aufwenden, wie wir später sehen werden. Nur während seiner Herstellung wird ein Protein durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert. Es stellt sich also die Frage, wie sich der Komplex aus Ribosom und wachsender Polypeptidkette an die ER-Membran anlagert. Wodurch wird die Signalsequenz erkannt? Was ist zur Anlagerung notwendig? Um diese Fragen beantworten zu können, haben Graham Warren und ich am Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie in Heidelberg Mikrosomen der Bauchspeicheldrüse in lösliche und membranintegrierte Bestandteile zerlegt. Durch Entzug oder Zugabe der löslichen Komponenten fanden wir, daß für den Transport ein löslicher, zytosolischer Faktor notwendig ist. Spätere Arbeiten von Peter Walter im Labor von Blobel identifizierten diesen Faktor als das signalerkennende Partikel, SRP: signal recognition particle. In meiner Arbeitsgruppe am EMBL fanden wir eine zweite wichtige Komponente in der Membran, das sogenannte Docking Protein, auch SRP-Rezeptor genannt. Wenn wir die Membranen mit geringen Konzentrationen einer Protease behandelten, waren sie nicht mehr in der Lage, Eiweiße zu transportieren. Ein für den Transport essentielles Protein an der Membran war offensichtlich von der Protease zerstört worden. David Meyer, damals Postdoc in meinem Labor, hat das Protein in den Membranen identifiziert und charakterisiert. Er konnte zeigen, daß es für das "Andocken" des SRP-Ribosom-Komplexes an die Membran notwendig ist. SRP besteht aus einer Ribonukleinsäure - 7S RNA - und sechs verschiedenen Proteinen. Es kann als Adapter zwischen der Signalsequenz einer wachsenden Polypeptidkette und der Membran des Endoplasmatischen Retikulums angesehen werden. Wenn etwa 60 Aminosäuren eines sekretorischen Proteins synthetisiert worden sind, bindet SRP an die Signalsequenz und bildet einen stabilen Komplex. Dabei stellt das 54 000 Dalton große Protein - SRP54 - den Kontakt zur Signalsequenz her. Es ist quasi der Postbote, der die Postleitzahl liest. Es besteht aus einer Signalsequenz- Bindedomäne, einem energieverbrauchenden Schalterelement - damit bezahlt die Zelle für den Transport - und einer Bindestelle für den SRP-Rezeptor.

Solange kein Kontakt mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums zustande kommt, bleibt die Synthese des zu transportierenden Proteins unterbrochen. Hierdurch stellt die Zelle sicher, daß alle sekretorischen Proteine wirklich an der Membran synthetisiert werden, durch die sie dann transportiert werden. Erst wenn der Kontakt mit dem SRP-Rezeptor hergestellt ist, wird das Protein weitersynthetisiert und gleichzeitig durch die Membran geschleust.

Drei Schaltelemente, die von dem Energielieferanten Guanintriphosphat, GTP, abhängig sind, regeln den exakten Ablauf der Beförderung; eins im signalsequenzbindenden Protein SRP54 und je eins in der a- und der b-Untereinheit des SRP-Rezeptors in der ER-Membran. Die Schalter sind auf "an" gestellt, wenn GTP gebunden ist, und nach Abspaltung eines Phosphatrests in "aus"- Stellung. Welche Transportschritte im einzelnen durch die Schaltelemente reguliert werden, ist noch nicht bekannt. Wir wissen aber, daß für die Freisetzung der Signalsequenz vom SRP sowohl der SRP-Rezeptor in der ER-Membran als auch GTP erforderlich sind.

Nachdem der Rezeptor die Signalsequenz freigesetzt hat, dringt die wachsende Proteinkette in die Membran ein. Da dieser Prozess nur während der Synthese eines Proteins abläuft, ist es schwierig zu klären, ob der Transport durch eine Art Proteinkanal in der Membran erfolgt oder direkt durch die Lipide, aus denen die Membran aufgebaut ist. Während wir für die Signalhypothese den Transport durch einen Proteinkanal postulierten, gab es andere Gruppen, die den direkten, proteinunabhängigen Transport favorisierten. Um das che- mische Umfeld der wachsenden Proteinkette während der DVersendung" zu analysieren, haben wir die Eiweißkette mit den sie umgebenden Komponenten quervernetzt und die entstehenden Komplexe charakterisiert. Dazu haben wir an bestimmten Stellen einer Signalsequenz eine chemisch modifizierte Aminosäure eingebaut. Die Modifikation besteht aus einer chemisch sehr reaktiven Gruppe, die, durch Licht aktiviert, mit benachbarten Molekülen eine feste (kovalente) Verbindung eingeht. In Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Tom Rapoport im Max- Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin, und Joseph Brunner, ETH Zürich, ist es uns gelungen, ein zentrales Protein der Translokationsstelle im endoplasmatischen Retikulum zu identifizieren. Das "Sec61" sitzt in der Membran des endoplasmatischen Retikulums und ist Teil eines größeren Komplexes, in dem sich neben den Komponenten, die an der eigentlichen Translokation beteiligt sind, auch Proteine befinden, die für die Modifikation von transportierten Proteinen verantwortlich sind, zum Beispiel für die Abspaltung der Signalsequenz und die Anheftung von Zuckermolekülen.

Signalsequenzen sekretorischer Proteine von Bakterien und Tieren sind sich in ihrer wesentlichen Eigenschaft sehr ähnlich - sie haben alle eine hydrophobe Region - und können zum Teil sogar im anderen System funktionieren. Das heißt, der Code für die Adressen, die "Postleitzahl", ist in allen lebenden Systemen weitgehend gleich. Das gleiche gilt für die Rezeptorkomponenten, die das Signal "lesen". In Bakterien haben wir ebenfalls ein signalerkennendes Partikel, SRP, gefunden, zwar nicht so aufwendig gebaut wie das tierische Gegenstück, aber doch mit einer kleinen Ribonukleinsäure und einem signalsequenzerkennenden Protein bestückt. Joen Luirink, EMBL, konnte zeigen, daß dieses Partikel spezifisch Signalsequenzen wachsender Polypeptidketten erkennt. Einen möglichen Rezeptor für das bakterielle SRP haben wir identifiziert, das "FtsY- Protein", das große Ähnlichkeit zum tierischen SRP-Rezeptor zeigt. Auch Teile des Translokationskanals in der Membran haben Bakterien und tierische Zellen gemeinsam. Das Sec61-Protein, das ursprünglich in Hefezellen durch genetische Selektion identifiziert wurde, ist homolog zum "SecY-Protein" des Bakteriums Escherichia Coli.

Der generelle Transportmechanismus, das "Zustellsystem" der Zelle, ist also in bakteriellen und tierischen Zellen weitgehend gleich: Für die Beförderung brauchen die Proteine eine Signalsequenz. Die wird von Rezeptoren erkannt und führt zum Andocken an die Membran. Der eigentliche Transport erfolgt durch einen Proteinkanal mit Hilfe von Helferproteinen auf der Innen- und Außenseite der Membran.

Autor:
Prof. Dr. Bernhard Dobberstein
Zentrum für Molekulare Biologie Heidelberg der Universität Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 282, 69120 Heidelberg,
Telefon (06221) 56 68 20

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