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Gentherapie mit Selbstmordgenen

Die Idee ist bestechend: Tumorzellen sollen in den Selbstmord getrieben werden, in dem man ihnen Gene einpflanzt, welche die entarteten Zellen – und nur sie – empfindlich auf Krebsmedikamente reagieren lassen. Uwe Haberkorn von der Radiologischen Universtitätsklinik Heidelberg beschreibt das Prinzip dieser neuen Gentherapie von Tumoren, zeigt Möglichkeiten der Optimierung und nennt die Hürden, die auf dem Weg zum Ziel noch genommen werden müssen.

Ein grundlegendes Problem der Therapie bösartiger Tumoren ist, daß sich normale und entartete Zellen äußerlich nur wenig unterscheiden. Therapien wie Operation und Strahlentherapie sind nur dann erfolgversprechend, wenn die Tumorzellen noch örtlich begrenzt wachsen und sich noch nicht vom Ort ihrer Entstehung entfernt haben. Haben sich die bösartigen Zellen ausgebreitet, ist eine systemische, den ganzen Körper betreffende Behandlung erforderlich. Mittlerweile stehen eine Reihe verschiedener Medikamente (Chemotherapeutika) zur Verfügung, mit denen Krebszellen zerstört werden können. Die Heilungsrate ist dennoch nur begrenzt. Erfolge, wie bei der Chemotherapie von Lymphomen und kindlichen Leukämien, blieben bislang bei den häufigen Tumoren der Lunge, der Brust oder des Dickdarms aus. Die Fortschritte der modernen Molekularbiologie haben inzwischen besser verstehen lassen, wie Krebs entsteht, wie Krebszellen sich ausbreiten und wie das Immunsystem auf die entarteten Zellen reagiert. Diese Erkenntnisse sind die konzeptionelle und methodische Grundlage, um neue Strategien gegen den Krebs zu entwickeln. Gelänge es beispielsweise, tumortypische Eigenschaften zu charakterisieren, die Krebszellen eindeutig von gesunden Zellen unterscheiden, könnten neue Therapien entwickelt werden, mit denen es möglich wäre, Tumoren gezielt zu bekämpfen, ohne daß Resistenzen (Unempfindlichkeiten) gegenüber Standardtherapeutika auftreten. Die "Somatische Gentherapie" – die Übertragung von Genen in Körperzellen mit therapeutischem Ziel – ist eine dieser neuen Behandlungsversuche.
In experimentellen und klinischen Studien werden derzeit vier neue Ansätze erprobt:
  1. der Schutz von gesundem Gewebe vor der zellzerstörenden Wirkung von Anitkrebsmedikamenten (Zytostatika, Chemotherapeutika);
  2. die verbesserte Immunabwehr von Tumorzellen;
  3. die "Rückverwandlung" entarteter in normale Zellen;
  4. die direkte Zerstörung von Tumorzellen durch die Übertragung von "Selbstmord-Genen".
Der Schutz von gesundem Gewebe, etwa dem Knochenmark, vor der Zellzerstörung durch Zytostatika könnte beispielsweise erreicht werden, wenn man den zu schützenden Zellen das Gen für das "p-Glykoprotein, eine Art Medikamentenpumpe in der Zellwand, überträgt. Wäre eine derartige Pumpe in Knochenmarkzellen aktiv, könnte die Konzentration von Chemotherapeutika im Innern von Knochenmarkstammzellen auf niedrigem, für die Zelle nicht giftigem Niveau gehalten werden. Die wichtigen Stammzellen, aus denen alle Zellen des Blutes hervorgehen, wären so selektiv geschützt.
Die Immunabwehr von Tumorzellen könnte durch die gesteigerte Aktivität von immunkompetenten Zellen verbessert werden, die sich im Tumor anreichern (sogenannte tumor-infiltrierende Lymphozyten). Auch die Tumorzellen selbst könnten so verändert werden, daß sie vom Immunsystem besser erkannt werden. Zur Zeit wird beispielsweise versucht, Gene in Tumorzellen einzuschleusen, die die Information für ein körperfremdes Oberflächenantigen (ein Antigen ist ein "Erkennungszeichen"= Protein auf der Oberfläche von Zellen) tragen. Diese Proteine würden nach erfolgreichem Gentransfer von der Tumorzelle selbst hergestellt und auf ihrer Oberfläche präsentiert. Das Immunsystem soll durch das fremde Oberflächenantigen zu einer Reaktion provoziert werden. Gleichzeitig soll das fremde Antigen auf bislang unerkannt gebliebene Tumoroberflächenantigene aufmerksam machen, so daß nicht nur die genetisch veränderten, sondern auch die nicht modifizierten Tumorzellen zerstört werden. Ein anderer Ansatz erprobt, inwieweit es möglich ist, die Produktion von Zytokinen (Botenstoffen des Immunsystems) in tumor-infiltrierenden Lymphozyten oder in den Tumorzellen selbst zu stimulieren. Über einen künstlich erhöhten Zytokinspiegel im Tumor soll so eine lokale Immunantwort ausgelöst werden.

Sorgfältig geplanter Suizid

Um eine bösartig entartete Zelle in eine gesunde rückzuverwandeln, gibt es theoretisch verschiedene Möglichkeiten. Beispielsweise könnte die Aktivität bestimmter Gene, sogenannter Krebsgene (Onkogene), unterdrückt werden, in dem man ihre natürlichen Gegenspieler, die "Tumorsuppressorgene", in die entartete Zelle einbringt. Von den Onkogenen hergestellte Proteine könnten inaktiviert werden, indem man spezielle Antikörper, sogenannte Intrabodies, einschleust. Auch mit Hilfe sogenanner Antisense-Oligonukleotide – sie machen genetische Informationen unlesbar – und mit Ribozymen – sie zerschneiden genetische Informationen in unlesbare Schnipsel – ist es denkbar, die Aktivität von Onkogenen zu unterdrücken. Eine direkte Zerstörung von Tumorzellen wäre durch die Übertragung von Genen, die Zellgifte herstellen, oder von Selbstmordgenen (Suizidgenen) möglich. Selbstmordgene sorgen gewöhnlich dafür, daß Enzyme hergestellt werden, die normalerweise nicht in menschlichen Zellen vorkommen. Die Enzyme wandeln ungiftige oder wenig giftige Vorläufermedikamente (Prodrugs) in giftige Stoffwechselprodukte um. Nach der gentechnischen Manipulation des Tumors wird das Vorläufermedikament verabreicht. Im Tumor wird es dann zu einem giftigen Stoffwechselprodukt umgewandelt – die Tumorzellen sterben ab. Die derzeit bekanntesten Selbstmordgene sind die Gene für die Enzyme Cytosin-Deaminase (CD) und die Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (HSVtk). Selbstmordgene können mit Hilfe gentechnisch veränderter Viren in den Tumor übertragen werden. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit zwei viralen Transportsystemen (Vektoren): Retroviren und adenoassoziierte Viren (AAV). Mit Retroviren als Vektoren erfolgen derzeit die meisten klinischen Gentherapiestudien. Ihre Bevorzugung beruht auf der einfachen Struktur des retroviralen Genoms, die das Entfernen der viralen Gene erlaubt, ohne daß regulatorische Sequenzen beeinflußt werden, die für den viralen Lebenszyklus unabdingbar sind. Derartig defekte Viren können als Vehikel eingesetzt werden, um neue genetische Information auf Zielzellen zu übertragen. Das modifizierte virale Genom wird in die DNA der Zielzelle integriert. Retrovirale Vektoren infizieren in der Regel proliferierende (sich teilende) Zellen und eignen sich daher zum Gentransfer in Tumorzellen.
Das Adeno-assoziierte-Virus-2 (AAV2) gehört zu den Parvoviren. Damit sich das Virus vermehren kann, benötigt es ein zweites Virus (Ko-Infektion mit einem Helfervirus), gewöhnlich ein Adeno- oder Herpes-Simplex-Virus. Ist das Helfervirus nicht vorhanden, wird AAV spezifisch in das menschliche Chromosom 19 eingebaut.
Von großer Bedeutung ist, daß die als Genvektoren eingesetzte Viren nur das Tumorgewebe, nicht aber andere, gesunde Gewebe infizieren. Retroviren beispielsweise infizieren bevorzugt Zellen, die sich gerade teilen. Tumorzellen teilen sich rasch – aber auch Zellen des Knochenmarks oder des Darms. Es muß daher dafür gesorgt werden, daß die viralen Vektoren nur Tumorzellen infizieren oder daß die übertragenen Gene nur in Tumorzellen abgelesen werden. Eine mögliche Lösung des Problems einer unspezifischen Infektion ist, gewebespezifische regulatorische DNA-Abschnitte (Promotoren) zu verwenden. Diese DNA-Abschnitte werden im Idealfall nur in einem bestimmten Gewebetyp von speziellen Proteinen (Transkriptionsfaktoren) aktiviert und sorgen dann für das Abschreiben des nachgeschalteten Gens. Kommt es zu einer unspezifischen Infektion, würden die unter der Kontrolle des gewebsspezifischen Promotors stehenden Gene dennoch nur im zu therapierenden Tumor angeschaltet werden. Beispiele für ein derartiges Vorgehen sind in der Fachliteratur bereits beschrieben, etwa bei Leberkrebs oder Hautkrebs. Auch das Schilddrüsengewebe ist für eine derartige Vorgehensweise geeignet. Es weist ein typisches Muster von Proteinen auf, das auch in vielen Schilddrüsentumoren anzutreffen ist. Eines dieser Proteine ist das Thyreoglobulin. Viele Schilddrüsenkarzinome scheiden Thyreoglobulin (Tg) mit hohen Serumwerten aus. Die Tg-Bestimmung wird daher zur Verlaufsbeobachtung eingesetzt, um ein Wiederauftreten des Tumors frühzeitig zu erkennen. Patienten mit erhöhten Tg-Werten werden dann mit bildgebenden Verfahren weiter untersucht. Aufgrund der starken Thyreoglobulin-Bildung bei den meisten Schilddrüsenkrebsen sollte der Thyreoglobulin-Promotor eine Gewebespezifität beziehungsweise Tumorspezifität gewährleisten.
Ein anderer in der Schilddrüse entstehender Tumor, das medulläre oder C-Zellkarzinom, geht von den Calcitonin-produzierenden Zellen (C-Zellen) der Schilddrüse aus. Die Tumoren stellen als Hauptgenprodukt der Zelle das Peptidhormon Calcitonin her. Dieses Peptid wird zwar auch von anderen Geweben, etwa der Nebenniere und Hypophyse, gebildet – diese Gewebe haben jedoch keine nennenswerte Teilungssaktivität. Die Verwendung des Calcitoninpromotors kombiniert mit einem Retrovirus oder AAV ist deshalb ein vielversprechender Ansatz, um ein Selbstmordgen zu übertragen, das nur in den Zellen des Tumors aktiv wird.
Einer der wenigen charakteristischen Unterschiede der meisten Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen ist ihr erhöhter Zuckertransport. Mittlerweile konnte eine ganze Familie von Transporterproteinen für Zucker identifiziert werden. Insbesondere die Bildung des "Typ 1" wird in entarteten Zellen aktiviert. Diese Veränderung tritt sehr früh im Laufe der Entartung von Zellen auf. Bei der Verwendung dieses Promotors sollte zu erwarten sein, daß die therapeutischen Proteine spezifisch in der Tumorzelle hergestellt werden.
Unsere Arbeitsgruppe arbeitet vorwiegend mit dem Thyreoglobulinpromotor, dem Calcitoninpromotor und den Glukosetransporterpromotoren. Gemeinsam mit der Klinischen Kooperationseinheit Dermatologie des Deutschen Krebsforschungszentrums in Heidelberg (Prof. Dirk Schadendorf) werden virale Vektoren zur Gen-übertragung bei Hautkrebs (siehe Ruperto Carola 3/98) entwickelt und erprobt. Derzeit werden adenoassoziierte Viren als Vektoren verwendet. Bisher liegen Zellkulturdaten mit Konstrukten für das C-Zellkarzinom vor. Sie belegen die gewünschte spezifische Wirkung auf diese Karzinomzellen: C-Zellkarzinomzellen sterben nach der Infektion mit dem Virus und anschließender Therapie mit dem Zytostatikum Gancyclovir ab: In anderen Tumorzellen, die den Promotor nicht aktivieren, kommt es zu deutlich geringeren Effekten.

Schritte der Gentherapie

Eine Gentherapie mit Suizidgenen erfolgt in zwei Schritten: Zunächst wird der Tumor mit gentechnisch veränderten Viren infiziert; das Ziel dabei ist, das Selbstmordprotein in den infizierten Zellen herzustellen. Ist dies erreicht, wird eine ungiftige oder nur wenig giftige Substanz, das Prodrug, verabreicht. Das Prodrug gelangt in die Tumorzellen und wird dort zu einem giftigen Stoffwechselprodukt umgewandelt.
Zur Planung der Gentherapie ist es notwendig, die künstlich im Tumor erzeugte Enzymaktivität zu bestimmen, um sicherzustellen, daß eine therapeutisch ausreichende Enzymaktivität erreicht ist, bevor das Prodrug verabreicht wird. Die Enzymaktivität im Tumor kann mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET), einem nuklearmedizinischen Verfahren zur Bestimmung biochemischer und physiologischer Abläufe im menschlichen Körper, abgeschätzt werden. Damit sind zwei Ansätze funktioneller bildgebender Verfahren zur Optimierung der Therapie und zur Verlaufsbeobachtung möglich: die Bestimmung der durch die Viren übertragenen neuen Stoffwechselfunktion (Enzymaktivität) und die Messung von daraufhin erfolgenden Veränderungen des Tumorstoffwechsels zur frühzeitigen Kontrolle der Effizienz der gesamten Therapie.
Zur Prüfung dieses bildgebenden Ansatzes wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Tumormodell gewählt, das sowohl Experimente mit Zellkulturen als auch Versuche mit Tieren erlaubt. Nach der gentechnischen Veränderung tierischer Tumorzellen mit einem viralen Vektor, der ein Selbstmordgen trug, konnten Zellen erzeugt werden, die auf das Zytostatikum Gancyclovir zuverlässig empfindlich reagieren. Dieses Tumorsystem verwendeten wir, um die Aufnahme von Gancyclovir in einer genetisch veränderten, das heißt, HSVtk-bildenden Zell-Linie und einer unveränderten Kontroll-Zell-Linie zu messen. Es zeigte sich, daß Gancyclovir von den Zellen, denen das Selbstmordgen übertragen worden war und die das entsprechende Enzym (HSVtk) bildeten, besser aufgenommen und in eine aktive Form überführt wurde. Bei den unveränderten Kontrollzellen hingegen konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden.
Nicht jede einzelne Tumorzelle muß HSVtk bilden, damit eine komplette Tumorrückbildung erreicht werden kann. Tumorzellen, in der Nähe von HSVtk-bildenden Zellen lokalisiert, werden ebenfalls empfindlich für Gancyclovir, ein Phänomen, das als "Bystander-Effekt" bezeichnet wird. Der Effekt ist wesentlich davon abhängig, ob ein bestimmter Schwellenwert an Enzymaktivität erreicht wird. Auch diese unterstreicht, wie wichtig es ist, die Enzymaktivität im Rahmen gentherapeutischer Maßnahmen zu messen.

Hilfreicher Beistand

Das Enzym wandelt das Zytostatikum Gancyclovir in Gancyclovir-Monophosphat um. Dieses Molekül kann die Zelle nicht mehr verlassen; es reichert sich in ihr an. Demnach müßte die Menge an angereichertem und radioaktiv markiertem Gancyclovir das Maß der im Tumor erreichten Enzymaktivität widerspiegeln.
Auch die Gesamtaufnahme an markiertem Gancyclovir im Tumor (das heißt, in HSVtk-bildenden Zellen und in benachbarten Zellen ohne HSVtk-Expression) ist ein Indikator für den Bystander-Effekt. Daher erfolgten Experimente mit verschiedenen Mischungen HSVtk-bildender Zellen und Kontrollzellen. Es zeigte sich, daß die Aufnahme des spezifischen Substrats und die erreichbare Wachstumshemmung deutlich vom Anteil HSVtk-bildender Zellen abhängig ist. PET- Studien mit geringen Mengen an radioaktiv markierten spezifischen Substraten (Substanzen, die von HSVtk verstoffwechselt werden) wie Gancyclovir könnten daher eingesetzt werden, um die Aktivität von HSVtk im Tumor abzuschätzen.
Um den Erfolg einer Gentherapie mit Selbstmordgenen zu beurteilen, ist es von großer Bedeutung, die Enzymaktivität in den Tumorzellen zu bestimmen. Zur Messung dieser Aktivität können sowohl Marker für die Zellproliferation als auch die Anreicherung spezifischer Substrate der Suizidenzyme dienen. Für die konkrete Anwendung bedeutet dies, daß vor einer Gentherapie mit Selbstmordgenen zunächst Messungen mit einem spezifischen Substrat und einer radioaktiven Substanz erfolgen könnten, um den Tumorstoffwechsel zu erfassen. Nach der Verabreichung des viralen Vektors könnten Studien mit einem spezifischen Substrat für das Selbstmordgen vorgenommen werden. Auf diese Weise ließe sich die erreichte Enzymaktivität im Tumor bestimmen. Diese Information ist dann ausschlaggebend für die Entscheidung, wann tumorzellzerstörende Medikamente wie Gancyclovir gegeben werden können. Danach erfolgende PET-Studien des Tumorstoffwechsels dienen zur Beurteilung des Therapieerfolges.
In nächster Zukunft wird sich unsere Arbeitsgruppe damit beschäftigen, die viralen Vektoren weiterzuentwickeln. Das Ziel dabei ist, die Effizienz der Gentherapie mit Selbstmordgenen zu steigern und eine Gewebespezifität zu erreichen. Darüber hinaus arbeiten wir an der Entwicklung neuer, nuklearmedizinisch nutzbarer Therapiesysteme, die zur Anreicherung von Radioaktivität im Tumor führen. Außerdem wollen wir neue stabile Trace erproben, um die künstlich im Tumor erzeugte Enzymaktivität darzustellen.


Autor:

Prof. Dr. Uwe Haberkorn,
Radiologische Universitätsklinik, Im Neuenheimer Feld 400, 69120 Heidelberg,
Abteilung für Nuklearmedizin,
Telefon (06221) 56 77 31

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