Pfadfinder im neuronalen Netz

Das Gehirn des Menschen besteht aus schätzungsweise 200 Milliarden Nervenzellen. Alle diese Zellen müssen sich während der Embryonalentwicklung miteinander vernetzen, damit aus einer amorphen Masse ein denkendes, fühlendes, lernendes und steuerndes Ganzes entsteht. Wie die korrekte "Verdrahtung" der unzähligen Nervenzellen erfolgt, ist eine der spannenden Fragen, die die Arbeitsgruppe Entwicklungsneurobiologie im Zoologischen Institut der Universität Heidelberg beantworten möchte. Elisabeth Pollerberg, die Leiterin der Gruppe, schildert, wie Nervenzellen ihre typischen langen Fortsätze bilden, wie sie sich orientieren, den richtigen Pfad einschlagen und was ihnen ihre eindrucksvollen "Wendemanöver" ermöglicht.

Ansicht des Gehirns mit den beiden großen Augen des Huhnembryos. Aus den Augen treten die beiden optischen Nerven aus. Sie überkreuzen sich und laufen zum Mittelhirn.

Heute wissen wir, dass das Gehirn eines erwachsenen Menschen etwa 200 Milliarden (2x10¹¹) Neurone und dazu noch etwa eine Trillion (10¹²) unterstützende Zellen enthält. Die Fortsätze der Neurone – die Axone und Dendriten – besitzen eine Gesamtlänge von schätzungsweise einer halben bis einer Million Kilometern. Aneinander gelegt reichen die Nervenfortsätze eines einzigen Gehirns also einmal zum Mond und zurück.

Das Neuron bildet mit seinen Fortsätzen mehr als zehntausend Verbindungen – so genannte Synapsen – zu anderen Neuronen aus. Erst im Jahr 2030, schätzen Experten, wird man in der Lage sein, einen Computer zu bauen, der ähnlich komplex wie unser Gehirn ist – eine vergleichbare Flexibilität und Schnelligkeit wird der Computer dann immer noch nicht haben.

Während der Embryonalentwicklung des Menschen entstehen pro Minute durchschnittlich 250000 neue Nervenzellen. Sie müssen sich alle sinnvoll miteinander verknüpfen, damit aus einer Zellmasse ein funktionstüchtiges Gehirn wird. Hier stellt sich die Frage: Welche Mechanismen gewährleisten, dass sich die Neuronen korrekt miteinander vernetzen?

Dies ist auch eine der Fragen unserer Arbeitsgruppe "Entwicklungsneurobiologie". Wir interessieren uns beispielsweise dafür, wie die langen Fortsätze der Nervenzellen (Axone), die später die Erregung zu anderen Neuronen weiterleiten, aus den gerade entstandenen Nervenzellen auswachsen. Wie finden sie – durch das sich bildende Nervengewebe hindurch – zu ihrem Zielgebiet? Wie bilden sich dort Synapsen? Unser Ziel ist es, das Verhalten der Axone während ihres Wachstums und ihrer Orientierung zu dokumentieren und die zu Grunde liegenden molekularen Interaktionen aufzudecken.

Ein vier Tage alter Huhnembryo : Zu erkennen ist das leicht pigmentierte linke Auge und das Mittelhirn, das wie ein Bowler-Hut darüber sitzt.

Als Modellsystem benutzen wir das sich entwickelnde visuelle System des Huhnembryos: Bestimmte Neuronen müssen sich in der Retina des Auges – die, wie auch die Netzhaut des Menschen, Bestandteil des zentralen Nervensystems ist – mit dem Mittelhirn "verdrahten". Die Axone dieser so genannten Retina-Ganglienzellen müssen also aus dem Auge herausfinden, in den optischen Nerv einwachsen und im Mittelhirn eine ganz bestimmte Zielregion finden. Diese Projektionsgebiete der Axone sind dabei eine spiegelbildliche Abbildung der Nachbarschaftsbeziehungen ihrer Zellkörper in der Retina. Das ist die Grundvoraussetzung, um einen bildlichen Sinneseindruck aufzubauen. Das Zielgebiet eines jeden auswachsenden Axons ist also vorhersagbar, und Störungen in diesem System können relativ einfach und eindeutig erkannt werden.

Darüber hinaus bietet das experimentelle System Huhnembryo noch viele weitere Vorteile. In dem sehr frühen Embryonalstadium, in dem sich das visuelle System entwickelt, ist der nur wenige Millimeter große Huhnembryo von anderen Wirbeltieren, auch dem Menschen, kaum zu unterscheiden. Er kann also als generelles Modellsystem dienen. Mittlerweile ist es uns auch gelungen, aus den embryonalen Retina- und Mittelhirnzellen "unsterbliche" Zelllinien zu entwickeln, das heißt Zellen, die sich permanent teilen. Diese Zelllinien können unbegrenzt in Kultur gehalten werden.

Eine ausgewachsene Retina-Ganglienzelle : Vom rundlichen Zellkörper (links) geht das Axon aus; an der Spitze des Axons ist der handförmige Wachstumskegel zu sehen.

Für die meisten Untersuchungen wird die Retina des Huhnembryos in einzelne Zellen oder in winzige Gewebestückchen aufbereitet, die dann in Zellkultur gehalten werden. Es ist aber auch möglich, das ganze Auge des Huhnembryos in Kultur zu halten. Dieses "Organkultursystem" hat es uns beispielsweise ermöglicht, die Rolle eines "Adhäsionsmoleküls" zu untersuchen. Adhäsionsproteine sitzen in der Oberfläche von Nervenzellen und vermitteln die Anheftung von Zellen an die Oberflächen anderer Zellen; sie können auch die Anheftung an Proteine vermitteln, die sich zwischen den Zellen befinden. Solche Adhäsionen ermöglichen den Zusammenhalt aller Gewebe unseres Körpers.

Für das heranreifende Nervensystem sind Adhäsionsproteine besonders wichtig. Denn die auswachsenden Nervenfortsätze können sich ohne diese Moleküle nicht an die Umgebung anheften: Ohne sie kommen sie also auch nicht "vorwärts". Außerdem bewirken die Zelladhäsionsproteine, dass die Zellmembran des Axons in engen Kontakt mit den Oberflächen umgebender Zellen kommt. Das Axon kann dann mit den Proteinen interagieren, die ihm letztlich die Weg- und Zielfindung ermöglichen.

Schnitt durch das Gehirn (links) und die Augen (rechts) des Huhnembryos in Organkultur

Eines dieser Neuronen-Adhäsionsmoleküle (NCAM = Neural Cell Adhesion Molecule) schalteten wir in unseren Versuchen mit einem Organkultursystem des Auges aus; das zweite Auge (in einer separaten Kulturschale) diente als Kontrolle. Um NCAM auszuschalten, ließen wir Antikörper an NCAM binden und verhinderten so, dass das Adhäsionsmolekül mit anderen Molekülen interagieren kann. Nach einem Tag in Kultur wurden die Retinae flach auf einer Membran ausgebreitet und die ausgewachsenen Axone mit Hilfe einer speziellen Färbung sichtbar gemacht.

Vergleicht man die Axone des sich normal entwickelnden Kontrollauges mit dem Auge, das mit Antikörpern behandelt wurde, zeigt sich, dass das Auswachsen der Retina-Ganglienzell-Axone nicht erkennbar gestört ist. Offensichtlich wird diese Funktion von anderen Zelladhäsionmolekülen übernommen. Stark gestört ist jedoch die Bündelung (Aneinanderhaftung) der Axone in Richtung optischer Nerv. Auch ihre Wegfindung aus dem Auge heraus ist beeinträchtigt. Der Versuch offenbart also, dass NCAM für die Bündelung der Axone und die Wegfindung essenziell ist.

Um die Funktionen eines weiteren Zelladhäsionsmoleküls – SC1 (Specific Chick 1) genannt – untersuchen zu können, bauten wir ein neues Kultursystem auf. In diesem System können wir gezielt die Interaktionen von Axonen manipulieren. Für das Kultursystem werden zwei winzige Gewebestreifen aus der Retina geschnitten und parallel nebeneinander gelegt. In Kultur gehalten wächst zwischen beiden Gewebestreifen ein dichter Teppich von Axonen aus.

Die beiden Mittelhirnhälften (rechts oben) und ein Auge (rechts unten) des Huhnembryos in Organkultur

Auf diese "Substrat-Axone" werden nun einzelne Retina-Ganglienzellen ausgesät, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sind. Diese Ganglienzellen lassen ihrerseits ihre Axone auf den schon vorhandenen Axonen auswachsen. Auch das Adhäsionsmolekül SC1 können wir mit Hilfe spezieller Antikörper ausschalten. Es stellte sich heraus, dass die Axone in den Versuchen, bei denen SC1 mit Hilfe von Antikörpern ausgeschaltet wurde, um 25 Prozent kürzer waren als in den Kontrollansätzen ohne Antikörperbehandlung. SC1 spielt also eine wichtige Rolle für das Auswachsen von Axonen auf Axonen. Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus, dass es noch weitere Adhäsionsmoleküle mit ähnlicher Funktion geben muss, die den Ausfall von SC1 teilweise kompensieren.

Damit Axone wachsen und sich orientieren können, sind nicht nur Moleküle der Zelloberfläche wichtig. Die Signale, die von den Molekülen der Zellmembran aufgenommen werden, müssen in das Innere des Neurons weitergeleitet werden, wo sie Struktur- und Funktionsänderungen bewirken. Dies trifft im besonderen Maße für eine dynamische, fühlerartige Struktur an der Spitze des Axons zu – den so genannten Wachstumskegel. Er ist vermutlich die eigentliche sensorische Struktur, die das Axon auf seinen Weg führt und sowohl die Richtung als auch das Tempo des Auswachsens bestimmt. Es wird davon ausgegangen, dass im Inneren des Wachstumskegels die verschiedenen Signale, die von der Zellmembran kommen, "verrechnet" werden. Dies führt letztlich zu einer Umorganisation des Zellskeletts (Zytoskelett).

Das Zytoskelett ist ein komplexes System von Gerüstproteinen, das unter anderem die Form und Stabilität von Axon und Wachstumskegel bestimmt. Denn weder das halbflüssige Zytoplasma noch die hauptsächlich aus Fetten (Lipiden) bestehende Zellmembran können bewirken, dass ein solch langer Zellfortsatz wie das Axon auswächst. Wenn der Wachstumskegel beispielsweise auf seiner linken Seite eine günstigere molekulare Umgebung (Substrat) zum Auswachsen vorfindet als rechts, wendet er sich nach links. Diese Bewegung wird möglich, weil das Zytoskelett auf der rechten Seite des Wachstumskegels abgebaut wird. Dadurch ziehen sich Membran und Zytoplasma rechts zurück: Wachstumskegel und damit auch das Axon erhalten eine neue Ausrichtung.

Um diese Prozesse zu untersuchen, mussten wir zunächst die "Spieler" im Inneren des Wachstumskegels der Retina-Ganglienzellen kennen lernen. Wir stellten dazu mehrere hundert verschiedene "monoklonale Antikörper" her. Diese Antikörper binden jeweils nur an ein einziges Molekül, das wir dadurch markieren, isolieren oder auch hemmen können. Einige unserer monoklonalen Antikörper markieren das Protein MAP1B (Microtubule-Associated Protein 1B). Es bindet an Mikrotubuli, die vorherrschende Zytoskelett-Komponente in Neuronen und stabilisiert sie so. Interessanterweise zeigte einer dieser Antikörper, der nur eine ganz spezielle Phosphorylierungsform von MAP1B (P1-MAP1B) erkennt, dass P1-MAP1B stets nur im stabilen Teil des Wachstumskegels zu finden ist. Andere MAP1B-Formen sind überall vorhanden.

Der Wachstumskegel an der Spitze eines Axons in Zellkultur (circa 3000fach vergrößert). Die fühlerartigen Fortsätze helfen dem Wachstumskegel, die Umgebung großflächig zu erkunden.

Dies konnten wir feststellen, indem wir die Wachstumskegel zunächst auf einem sehr guten Substrat wachsen, sie dann aber auf ein weniger gutes Auswachssubstrat stoßen ließen. Es ist dann zu beobachten, dass der Wachstumskegel zunächst mit etwa der Hälfte seiner Fläche auf das schlechtere Substrat vordringt – dann aber zieht er sich zurück. Das Axon wächst so auf dem besseren Substrat weiter. Bei diesen Wachstumskegeln können wir genau sagen, wo und wann das Zytoskelett auf- beziehungsweise abgebaut wird und wie dies mit der An- beziehungsweise Abwesenheit des P1-MAP korreliert.

Die daraus abgeleitete Arbeitshypothese ist, dass die Wachstumskegel-Region, die kein P1-MAP1B besitzt, kollabiert und dadurch Wachstumskegel und Axon in die gegenseitige Wachstumsrichtung gelenkt werden. Diese Hypothese konnten wir beweisen, indem wir P1-MAP1B in einer Wachstumskegelhälfte gezielt ausschalteten.

Das einzige System, das eine solche lokale Manipulation ermöglicht, ist die Protein-Inaktivierung mit einem sehr feinen Laserstrahl (Chromophore-Assisted Laser Inactivation; CALI). Die Methode wurde in Harvard entwickelt. In Deutschland wurde dieses System erstmals während meiner Gruppenleiterzeit am Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie in Tübingen aufgebaut. Nach dem Wechsel an die Universität Heidelberg im Jahr 1998 wurde CALI auch hier am Zoologischen Institut in unserer Abteilung Entwicklungsneurobiologie etabliert.

 

Für die lokale Inaktivierung müssen zunächst Antikörper gegen das auszuschaltende Protein – in unserem Fall also P1-MAP1B – in das lebende Neuron eingebracht werden. Dies geschieht, indem die Antikörper in Liposome – kleine Fettkügelchen – verpackt werden. Mit den Liposomen gelangen die Antikörper durch die Zellmembran. Der eigentliche Trick besteht darin, dass die Antikörper zuvor mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Malachitgrün) beladen werden. Dieser Farbstoff sorgt dafür, dass so genannte freie Radikale entstehen, sobald er von Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird. Die Radikale zerstören jedes Protein in ihrer Umgebung (Radius von sechs Nanometer).

Wir richten den Laserstrahl, der einen Durchmesser von circa zehn Mikrometer hat, nur auf eine Hälfte des vorwärts strebenden Wachstumskegels, beispielsweise auf seine rechte Seite. An dieser Stelle wird das Protein P1-MAP1B zerstört, da ja nur an diesem die Malachitgrün-gekoppelten Antikörper sitzen. Genau hier entstehen also auch die freien Radikale. Die Mikrotubuli werden in diesem Teil des Wachstumskegels nicht länger stabilisiert, die entsprechende Seite kollabiert und der Wachstumskegel samt Axon wendet sich in die gegenseitige Richtung, also nach links. Im Schnitt biegen die Axone rund 18 Grad vom ursprünglichen Kurs ab.

Diese komplexen Experimente demonstrierten erstmals, dass MAP1B eine wichtige Rolle für die Wendereaktionen des Wachstumskegels spielt. Wendereaktionen sind – neben den Bewegungen "vorwärts", "stop" und "zurück" – die grundlegenden "Verhaltensmöglichkeiten" eines auswachsenden Axons, nicht nur in Zellkultur, sondern auch im Embryo. Es kann also davon ausgegangen werden, dass MAP1B essentiell für den Aufbau eines funktionsfähigen Nervensystems ist. Dabei erwies sich die Natur einmal mehr als ausgesprochen ökonomisch: Sie transportiert das sehr große Protein MAP1B nicht von der einen Seite des Wachstumskegels auf die andere, sondern schaltet es lediglich in seiner stabilisierenden Funktion an oder aus. Dieses "An-und Auschalten" geschieht, in dem kleine Phosphatgruppen abgespalten (MAP1B: "aus") beziehungsweise angehängt werden (P1-MAP1B: "an").

Jetzt interessierten wir uns dafür, wer den "Schalter" betätigt. Die "Knipser" sind Kinasen – Enzyme, die Phosphatgruppen anhängen – und ihre Gegenspieler, die Phosphatasen – Enzyme, die diese Gruppen wieder entfernen. Wir haben bereits einige Kandidaten im Visier, und werden auch hier versuchen, ihre Funktion möglichst direkt zu zeigen. Die in Frage kommenden Enzyme sind meist nur für Maus oder Mensch charakterisiert. Wir arbeiten zur Zeit daran, eine Bibliothek derjenigen Gene zu erstellen, die "aktuell" in der Retina des Huhnembryos, in der gerade Axone auswachsen, abgelesen – das heißt, in Proteine übersetzt – werden.

Unter diesen Genen sollten wir auch diejenigen finden, in denen die Bauanleitung für die uns interessierenden Kinasen und Phosphatasen niedergeschrieben sind. Wenn wir deren Aufbau (Sequenz) kennen, können wir die Enzyme sowohl auf der molekulargenetischen Ebene (durch Aus- oder Anschalten der für deren Synthese benötigten Elemente) also auch auf der Proteinebene (durch Hemmung der Proteine, beispielsweise durch Antikörper oder chemische Substanzen) manipulieren. Die zu beobachtenden Effekte werden uns Aufschluss über die Funktion der einzelnen Proteine geben. Nach und nach möchten wir uns dann die gesamte Signalkaskade bis hin zur Zellmembran "hinaufarbeiten", so dass wir unter anderem auch wieder bei den anfangs beschriebenen Adhäsionsmolekülen in der Membran der Nervenzelle ankommen.

Unsere Forschungen sind zum größtem Teil reine Grundlagenforschung. Ganz besonders erfreulich ist, dass unserer Projekt seit Beginn dieses Jahres im Rahmen des neu eingerichteten Sonderforschungsbereichs der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert wird (SFB 488: "Molekulare und zelluläre Grundlagen neuraler Entwicklungsprozesse", siehe Ruperto Carola 2/2000). Wir arbeiten mit klinisch orientierten Kollegen zusammen, denn das Wachstum und die Orientierung von Axonen finden ja nicht nur im sich entwickelnden (embryonalen) Nervensystem statt, sondern auch bei regenerierenden Neuronen des erwachsenen Organismus. Auch für die Erforschung des Alterns und der Degeneration des Gehirns (unter anderem der Alzheimer-Krankheit) sind inbesondere die Mikrotubuli-assoziierten Moleküle, die wir untersuchen, interessant. Derartige Kooperationen werden künftig auch durch das neu gegründete "Interdisziplinäre Zentrum für Neurowissenschaften" (IZN) stärker gefördert werden.

Unsere eigene zentrale Fragestellung zielt jedoch unbelastet von Aspekten des unmittelbaren Anwendungsbezugs auf die Aufklärung derjenigen molekularen Vorgänge, die in Nervenzellen ablaufen, wenn sie das sich entwickelnde Gehirn "verdrahten".

Autorin:
Prof. Dr. G. Elisabeth Pollerberg
Institut für Zoologie, Im Neuenheimer Feld 237, 69120 Heidelberg,
Telefon (06221) 546370, Fax (06221) 546375, e-mail: gephd@zoo.uni-heidelberg.de