Testergebnis in 30 Sekunden

Leuchtende Moleküle sollen die Therapie mit Blutgerinnungshemmern sicherer machen
von Roland Krämer und Job Harenberg

Allein in Deutschland werden jährlich etwa 500 Millionen Tagesdosen gerinnungshemmender Medikamente verordnet. Die Blutgerinnung zu hemmen, ist allerdings eine heikle Gratwanderung: Die Medikamente müssen vor gefährlichen Blutgerinnseln schützen, sie dürfen die natürliche Gerinnung aber nicht so stark unterdrücken, dass innere Blutungen drohen. Eine wirksame und sichere Therapie ist daher oft nur in Kombination mit einer aufwendigen Laborkontrolle möglich. Chemiker und klinische Pharmakologen der Universität Heidelberg entwickeln derzeit neue Testverfahren, mit denen sich eine Behandlung mit blutgerinnungshemmenden Medikamenten schnell und zuverlässig überwachen lässt.

Sommer, Sonne und eine Erfrischung im Café. Das Tonic Water ist kalt und schmeckt angenehm bitter. In das Glas auf dem Tisch fällt ein Sonnenstrahl – und plötzlich beginnt der Inhalt himmelblau zu schimmern. Wenn Sie so etwas schon einmal erlebt haben, haben Sie Bekanntschaft mit leuchtenden Molekülen gemacht. Sowohl für den bitteren Geschmack des beliebten Softdrinks als auch für sein blaues Leuchten ist ein Molekül namens Chinin verantwortlich. Es wird vom ultravioletten Anteil des Lichts angeregt, blaues Licht abzustrahlen. Der Fachmann spricht von „Fluoreszenz“.

Das im Sonnenlicht blau aufleuchtende Tonic Water gehörte im 19. Jahrhundert zur Standardausrüstung der europäischen Kolonialtruppen: Der Gehalt an Chinin, der damals wesentlich höher als heute war, schützte die Soldaten vor Malaria. Das medizinische Interesse an der Wirkweise des Chinins und der Höhe des Chininspiegels im Blut hat im Laufe der 1950er-Jahre wesentlich zur Entwicklung der ersten Fluoreszenzspektrometer beigetragen – empfindliche Geräte, mit denen man Fluoreszenz messen kann.

Leuchtende Moleküle und Fluoreszenzspektrometer sind aus der modernen lebenswissenschaftlichen Forschung nicht mehr wegzudenken: Die Leuchtmoleküle werden als Marker oder Sonden verwendet; und die mittlerweile perfektionierten Messmethoden spüren die leuchtenden Marker noch in den kleinsten Mengen auf. Das Verfahren hatte bereits großen Anteil an wissenschaftlichen Meilensteinen, etwa der Entzifferung des menschlichen Erbguts oder der Möglichkeit, dem Treiben von Eiweißmolekülen unmittelbar im Innern lebender Zellen zuzuschauen (Chemie-Nobelpreis 2008).

In der Medizin werden fluoreszenzbasierte Methoden vor allem dann genutzt, wenn im Labor eine besonders hohe Nachweisempfindlichkeit gefordert ist. Ein Beispiel ist die moderne Infektionsdiagnose mit der sogenannten quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR). Das vervielfältigende Verfahren nutzt fluoreszierende Farbstoffe, um das Erbgut von Krankheitserregern sichtbar zu machen, und kann gefährliche Keime frühzeitig im Körper von Infizierten nachweisen. Die PCR-Methode wurde jüngst auch verwendet, um das Bakterium EHEC O104 zu identifizieren, das im Frühjahr 2011 eine Epidemie mit mehreren Todesfällen verursachte.

Heparine: Medikamente zur Hemmung der Blutgerinnung
Heparine sind nach den „Vitamin-K-Antagonisten“ diejenigen Medikamente, die am häufigsten verwendet werden, um die Blutgerinnung zu hemmen. Das ist bei Patienten erforderlich, bei denen eine erhöhte Bereitschaft zur Bildung von Blutgerinnseln besteht und die deshalb Gefahr laufen, gefährliche Gefäßverschlüsse, etwa im Herzen (Herzinfarkt) oder im Gehirn (Schlaganfall), zu erleiden. Allein in Deutschland haben Ärzte im Jahr 2009 rund 110 Millionen Tagesdosen Heparin nur für diese Patienten verordnet; weltweit wird die Zahl der Anwendungen auf über eine Milliarde jährlich geschätzt. In erster Linie dienen Heparine zur Prophylaxe, also dazu, dem Entstehen gefährlicher Gefäßverschlüsse vorzubeugen. In der Therapie werden sie verwendet, um das Fortschreiten von Blutgerinnseln zu verhindern; im günstigsten Fall können sie Gefäßverstopfungen wieder auflösen.

Gewonnen werden Heparine aus Schlachtabfällen des Schweinedarms, die in aufwendigen Fertigungsschritten gereinigt und aufbereitet werden. Chemisch betrachtet sind Heparine lange Ketten aneinandergereihter und modifizierter Zuckermoleküle. Die Molekülketten können im Laufe der Aufbereitung enzymatisch oder chemisch nachbehandelt werden. Dabei werden die Ketten gespalten und sie werden kürzer. Auf diese Weise ist eine Feinabstimmung der Wirkstoffeigenschaften möglich: Es resultieren unterschiedliche Heparin-Präparate.

Die Wirkung eines Heparins im Körper des Patienten muss immer dann kontrolliert werden, wenn der Blutspiegel des verwendeten Heparins oder dessen gerinnungshemmender Effekt nicht zuverlässig vorausgesagt werden kann. Das gilt vor allem für Heparinpräparate mit langen Molekülketten. Diese „unfraktionierten Heparine“ werden in der Medizin in hoher Dosis bei Bypass-Operationen, bei Herzkatheter-Behandlungen und in der Dialyse eingesetzt. Bei diesen Anwendungen kann es erforderlich sein, die Heparindosis rasch an veränderte Erfordernisse anzupassen. Es bleibt dann keine Zeit, das Ergebnis des Tests im Zentrallabor der Klinik abzuwarten. Die Überwachung erfolgt stattdessen mit speziellen Gerinnungstests direkt am Bett des Patienten. Diese Tests arbeiten schnell – sie können den Heparinspiegel im Blut jedoch nur grob schätzen, da das Ergebnis auch von anderen Einflüssen, etwa der Körpertemperatur, abhängt.

Kurzkettige (niedermolekulare) Heparinpräparate werden bei uns zumeist eingesetzt, um der Bildung von Blutgerinnseln, etwa vor chirurgischen Eingriffen, vorzubeugen oder um eine Thrombose, den Verschluss eines Gefäßes durch ein Gerinnsel, zu behandeln. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung kurzkettiger Heparine ist besser vorhersehbar als die langkettiger. Das Überwachen des Blutspiegels wird deshalb bei niedermolekularen Heparinen nur „bedingt“ empfohlen, beispielsweise bei Patienten, deren Nieren nur eingeschränkt arbeiten. Bei ihnen kann die Heparinausscheidung vermindert sein, was dazu führt, dass sich das Medikament im Blut anreichert und sich die Gefahr für innere Blutungen erhöht. Als „Goldstandard“ für das Bestimmen kurzkettiger Heparine gilt derzeit ein Labortest, der die Blockade eines bestimmten Gerinnungsfaktors analysiert. Dieser Test ist allerdings nicht in allen Kliniken verfügbar. Ein Schnelltest, wie es ihn für langkettige Heparine gibt, ist für kurzkettige Heparine bislang nicht etabliert.

Kreatives Moleküldesign
Das Ziel unseres interdisziplinären Forschungsprojekts ist es, die Überwachung der Heparintherapie zu verbessern. Wir wollen dazu einen Test entwickeln, der den Heparinspiegel im Blut unmittelbar, einfach, schnell und genau bestimmt. Heparin direkt im Blut zu messen, ist indes alles andere als einfach. Auffällige optische Eigenschaften – wie beim Chinin – sind bei Heparin nicht vorhanden. Zudem ist Heparin keine einheitliche Substanz, sondern ein Gemisch aus Zuckerketten unterschiedlicher Größe und Art. Das erschwert die Analyse. Hinzu kommt, dass auch das Blut, in dem die Heparine schwimmen, ein sehr komplexes Medium ist. Selbst wenn die roten und weißen Blutkörperchen aussortiert worden sind und nur noch die Flüssigkeit, das Blutplasma, vorhanden ist, sind darin noch unzählige kleinere Moleküle und Salze und über 200 Proteine enthalten. Das macht es schwer, die Heparine zu bestimmen. Zudem muss von einem neuen Test gefordert werden, dass er auch dann noch ausreichend empfindlich ist, wenn in einem Tropfen Blut weniger als ein Millionstel Gramm Heparin vorhanden ist.

Der Schlüssel zu einem neuen Test, der all diesen Anforderungen genügen kann, sind fluoreszierende Moleküle, die speziell kreiert wurden, um Heparine nachzuweisen. Dazu ist es erforderlich, die Strukturen der leuchtenden Moleküle quasi am Reißbrett genau zu planen und anschließend so zu realisieren, dass die gewünschten Eigenschaften und Funktionen resultieren.

Während der Planungen war es zunächst wichtig, die Farbe zu bestimmen, in welcher die für den Labortest vorgesehenen Moleküle leuchten sollen: Die Lieblingsfarben sind Gelb oder besser noch Rot. Weniger erwünscht sind grün und blau, denn die grüne und blaue „Autofluoreszenz“ – das Eigenleuchten von Blutbestandteilen – stört die Messung und würde den Test weniger empfindlich machen. Eine zweite wichtige Bedingung ist, dass das im Test eingesetzte Leuchtmolekül idealerweise nur an Heparin, nicht aber an andere Komponenten des Blutes bindet. Die exklusive Bindung eines fluoreszierenden Moleküls an Heparin kann mit „Tentakeln“ erreicht werden, die mit positiven Ladungen bestückt sind und dafür sorgen, dass das Leuchtmolekül bevorzugt am negativ geladenen Heparin haftet. Nun muss das Heparin selbst noch sichtbar werden, wozu es einer Änderung des Leuchtsignals bedarf. Dazu muss eine Art Lichtschalter umgelegt werden. Auch diese Eigenschaft lässt sich über ein rationales molekulares Design steuern: Licht aus, Licht an – selbst Farbwechsel werden möglich. Über ein Dutzend Heparin-sensitiver Moleküle mit unterschiedlichen Sensoreigenschaften sind inzwischen verfügbar. Das erlaubt es uns, das System mit der jeweils besten Performance auszuwählen.

Schnell und zuverlässig
Der spannendste Moment nach dem gezielten Design der Leuchtmoleküle war, unseren neuen Test erstmals einzusetzen, um Heparin in Blutproben von Patienten zu bestimmen. Die Premiere fand im Mannheimer Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie statt. Es gelang tatsächlich, den Heparinspiegel des Blutes durch ein einfaches Mischen von Blutplasma und Testreagenz und über die Messung der Fluoreszenz zu bestimmen – das Ergebnis liegt in weniger als 30 Sekunden vor. Der Test ist sehr einfach handhabbar, eine spezielle Einarbeitung ist nicht erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass der Test zugleich langkettige und kurzkettige Heparinpräparate bestimmen kann. Sonst werden dazu zwei unterschiedliche Labormethoden gebraucht. Bevor die Messung erfolgen kann, müssen jedoch die zellulären Bestandteile des Blutes durch Zentrifugation abgetrennt werden. Damit erfüllt unser Verfahren leider noch nicht alle Anforderungen, die an eine patientennahe Sofortdiagnostik idealerweise gestellt werden müssen.

Nichtsdestotrotz hat unser Test jetzt schon das Interesse von pharmazeutischen Unternehmen geweckt, die Medikamente mit heparinähnlichen Strukturen und neuen medizinischen Anwendungen entwickeln. In der nunmehr jahrzehntelangen Medikamentengeschichte der Heparine wurde immer wieder von „positiven Nebenwirkungen“ berichtet, etwa entzündungshemmenden Eigenschaften der Heparine oder einer Wirkung auf Krebszellen. Das hat die Entwicklung neuer heparinähnlicher Medikamente vorangetrieben.

Klinisch erprobt werden derzeit bereits heparinähnliche Wirkstoffe gegen Krebs, schwere Verlaufsformen der Malaria und entzündliche Darmerkrankungen. Bei den verwendeten Wirkstoffen sind die gerinnungshemmenden Eigenschaften reduziert, oder sie werden gezielt ausgeschaltet; infolgedessen sind herkömmliche Gerinnungstests nicht mehr geeignet, den Heparinspiegel im Blut zu bestimmen. Der von uns entwickelte neue Fluoreszenztest wird zurzeit von mehreren Pharmaunternehmen auf seine Eignung zur Kontrolle der Wirkstoffspiegel im Rahmen von Studien zur Medikamentenentwicklung geprüft.

Das größte Potenzial unseres Testes ist die schnelle Bestimmung des Blutheparinspiegels in der Klinik, besonders in akuten Situationen. Diese Anwendung setzt voraus, dass die Blutprobe eines Patienten direkt, ohne zeitraubende Zwischenschritte wie die Zentrifugation der Blutkörperchen, analysiert werden kann. Eine Lösung für das Zeitproblem könnte sein, statt der Zentrifugation spezielle Membranen zu verwenden, die die zellulären Bestandteile des Blutes gleich beim Aufbringen der Probe herausfiltern. Das Prinzip dieser Verfahrensweise demonstrieren unsere derzeit noch selbst gefertigten Heparin-Teststreifen, die kombiniert mit einem mobilen Handgerät zur Messung der Fluoreszenz eingesetzt werden können. Ob sich diese Methode tatsächlich für die diagnostische Anwendung qualifizieren kann, wird von ihrer Robustheit und Präzision abhängen.

Teststreifen für die rasche Kontrolle
Die Entwicklung neuer und schnellerer Tests zur Kontrolle des Blutheparinspiegels wurde von uns mittlerweile auch auf die neueste Generation von Gerinnungshemmern ausgedehnt, die „oral“ verabreicht, also als Tablette geschluckt werden können. Seit dem Jahr 2008 ist in Deutschland beispielsweise der oral einnehmbare Wirkstoff Rivaroxaban zugelassen, um Thrombosen vorzubeugen. Ein Vorteil der neuen Generation von Gerinnungshemmern in Tablettenform ist, dass die Dosis-Wirkungs-Beziehung gegenüber den heute noch zumeist verwendeten „Phenprocoumon-Präparaten“ (Marcumar) besser voraussagbar ist: Regelmäßige Blutabnahmen, um die Gerinnung bei langfristiger Einnahme zu kontrollieren, sind nicht mehr erforderlich. Dafür wurden die Entwickler von Rivaroxaban im Jahr 2009 mit dem Deutschen Zukunftspreis ausgezeichnet.

Unter Federführung des Mannheimer Instituts haben wir einen Teststreifen entwickelt, der Rivaroxaban im Urin nachweisen kann. Der Test ist so simpel wie ein Schwangerschaftstest; das Ergebnis kann nach wenigen Minuten als Fluoreszenzsignal oder auch mit bloßem Auge als Farbänderung abgelesen werden. Ähnliche Farbtests werden an der Universität Heidelberg derzeit für zwei weitere neue Medikamente entwickelt, und zwar für die oralen Gerinnungshemmer Dabigatran (zugelassen im Jahr 2008) und Apixaban (zugelassen im Jahr 2011). Die Universität hat für den Rivaroxaban- und Apixaban-Schnelltest ein internationales Patent angemeldet. Die Schutzrechte für den Dabigatran-Urintest haben die Erfinder nach Freigabe durch die Universität selbst in Anspruch genommen.

Unserer Einschätzung nach können die neuen Tests, für die kein Blut abgenommen werden muss, auch vom Hausarzt oder sogar vom Patienten selbst benutzt werden. Dies bietet eine zusätzliche Therapiesicherheit, etwa dann, wenn sich während der Behandlung die Nierenfunktion verschlechtert und eine Akkumulation des Medikaments im Blut droht oder wenn versehentlich eine zu hohe Dosis eingenommen wurde. Auch zur Überprüfung der Therapietreue oder bei Blutungskomplikationen lassen sich die Tests einsetzen. Von den genannten Problemen sind vor allem ältere Menschen mit Krebserkrankungen, Menschen, die an mehreren Krankheiten gleichzeitig leiden, und Patienten in Notfallsituationen betroffen.
Schnelltest für Krebs?

Heparinähnliche Verbindungen kommen auch natürlicherweise in unserem Körper vor. Die Oberfläche der meisten Zellen ist beispielsweise mit Heparansulfat-Ketten dekoriert, an die Proteine gekoppelt sind. Die „Heparansulfat-Proteoglykane“ unterscheiden sich von Heparin nur in strukturellen Details und haben wichtige zellregulatorische Funktionen. Auf vielen Krebszellen kommen sie in untypisch niedrigen oder hohen Mengen vor und können dann vermehrt in das Blut gelangen. Die nun im Blut zirkulierenden Heparansulfate eignen sich grundsätzlich als Marker, um bestimmte Krebsarten anzuzeigen. Die derzeit verfügbaren Nachweismethoden sind jedoch noch relativ aufwendig.

Eines der von uns entwickelten Leuchtmoleküle ist imstande, die Menge an Heparansulfat auf den Oberflächen von Zellen zu bestimmen. Auch im Blutplasma lässt sich Heparansulfat schnell und einfach nachweisen. Diese Beobachtungen sind noch neu. Sie lenken unsere Forschungsarbeiten in eine weitere spannende Richtung.

Der Schnelltest auf dem Weg vom Labor zum Patienten
Der neue Heparintest hat ein hohes Marktpotenzial – selbst dann, wenn er nur bei einem kleinen Teil der weltweit jährlich über eine Milliarde Anwendungen von Heparin eingesetzt würde. Ein Gründerteam, das aus Wissenschaftlern und Betriebswirten besteht, sieht darin eine chancenreiche Geschäftsidee und plant, die von der Universität Heidelberg international zum Patent angemeldete Schnelltest-Technik zu marktfähigen Produkten weiterzuentwickeln.
Das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie fördert das Vorhaben mit einem „Exist-Gründerstipendium“. Vor kurzem konnte sich die Geschäftsidee für die Endausscheidung des bundesweiten Businessplan-Wettbewerbs „Medizinwirtschaft“ qualifizieren. Der erste Schritt auf dem Weg zum marktfähigen Produkt ist nun, den Test in der Klinik zu prüfen und sein Können unter Beweis zu stellen.

Die Dietmar-Hopp-Stiftung unterstützt ab dem Jahr 2012 ein wissenschaftliches Projekt zur Entwicklung von Schnelltests für orale Gerinnungshemmer in der Medizinischen Fakultät Mannheim.

Job Harenberg (li) ist Professor für Innere Medizin in der Medizinischen Fakultät Mannheim. Er hat an den Universitäten Mainz und Heidelberg Medizin studiert und wurde von der Universität Heidelberg promoviert und habilitiert. Schwerpunkt seiner Forschungsarbeit ist die bessere Diagnose und Therapie von Gefäßverschlüssen, insbesondere neue Methoden zum Nachweis von blutverdünnenden Medikamenten.
Kontakt: job.harenberg@medma.uni-heidelberg.de

Roland Krämer (re) ist Professor am Anorganisch-Chemischen Institut der Universität Heidelberg. Er hat an den Universitäten Karlsruhe und München Chemie studiert, wurde in München promoviert und arbeitete anschließend an der Universität Straßburg. Der Habilitation an der Universität Münster folgten Rufe an die Universitäten Mainz (1998) und Heidelberg (1999). Seine Forschungsschwerpunkte sind die „Bioanorganische Chemie“ und die Entwicklung „Molekularer Sonden“ für Anwendungen im Bereich der Lebenswissenschaften.
Kontakt: kraemer@aci.uni-heidelberg.de