Pathogenese von Mutationen im mitochondrialen Genom

Mitochondriale Proteinsynthese und Zellatmung

Das humane mitochondriale Genom kodiert 22 tRNAs, jeweils eine für 18 der 20 Aminosäuren und jeweils zwei Isoakzeptoren für die Aminosäuren Leucin und Serin. Ferner enthält das mt Genom Gene für zwei ribosomale RNAs und 13 mRNAs. Dieses Ensemble bildet das Kernstück einer mitochondrialen Proteinbiosynthese, deren proteinogene Komponenten nunmehr im Kern kodiert sind und in die Mitochondrien importiert werden müssen. Einige typisch bakterielle Charakteristika, z.B. die Formylierung der Initiator-tRNAMet lassen noch die Abstammung von bakteriellen Vorfahren erkennen. Im Laufe der Evolution der Eukaryoten ist das ehemals autarke Genom der mitochondrialen Vorfahren fast vollständig in den Zellkern verlegt worden. Dieser Trend findet in Tierzellen einen vorläufigen Höhepunkt: hier ist das zirkuläre mt Genom nur noch 16 kb groß. Die Vermutung liegt nahe, dass dies mit dem deutlich höheren Energiebedarf (verglichen mit Pflanzen, deren mt Genome noch mehrere hundert kb groß sind) von Tierzellen zusammenhängt, welcher durch oxidative Phosphorylierung gedeckt werden muss, die eben in den Mitochondrien stattfindet. Wegen der fundamentalen Bedeutung der oxidative Phosphorylierung für die zelluläre ATP-Produktion führt eine Beeinträchtigung der Enzyme des Krebszyklus zu schweren Stoffwechselstörungen. Sowohl im nukleären, als auch im mitochondrialen Genom wurden pathogene Mutationen identifiziert, die auf diese Weise mitochondriale Myopathien verursachen. Dabei überwiegen die mitochondrialen mit bisher über 150 beschriebenen Mutationen zahlenmäßig deutlich, was wohl im Wesentlichen auf zwei Ursachen zurückzuführen ist. Zunächst ist das mitochondriale Genom extrem klein, übersichtlich, seit 1981 sequenziert (Anderson et al., 1981) und seine Mutationen werden leicht ursächlich mit der Atmungskette assoziiert und daher gezielt überwacht. Andererseits unterliegt das mt Genom einer im Vergleich zum nukleären Genom deutlich erhöhten Mutationsrate (Allen und Raven, 1996; Horai et al., 1992; Pesole et al., 1999) und einer extrem komplizierten Genetik, welche einen Teil des Selektionsdrucks, der auf normalerweise letale Mutationen wirkt, abfängt. Diese soll im folgenden Abschnitt unter besonderer Beachtung der mitochondrialen tRNAs skizziert werden.

Mitochondriale Genetik und Mutationen in mitochondrialen tRNAs

Eine typische Säugetierzelle enthält einige hundert bis wenige tausend Mitochondrien und somit, bei 4-10 Plasmiden mt DNA pro Mitochondrie, einige tausend Kopien mitochondrialer DNA. Replikation von mt DNA wird durch im Zellkern kodierte Faktoren gesteuert, geschieht jedoch unabhängig von der Replikation der nukleären DNA. Im Gegensatz zur klassischen Genetik zweier Allele im Zellkern können unterschiedliche mitochondriale DNAs in praktisch jedem Verhältnis, jedoch im Wesentlichen ohne Rekombination und gegenseitige Komplementierung vererbt werden (Enriquez et al., 2000). Die resultierende langsame genetische Degradation der nur mütterlicherseits vererbten mt DNA wird zutreffend mit einem Model beschrieben, welches Müllers Ratchet genannt wird (Lynch, 1996; Börner et al., 1997).
Es existiert offensichtlich hoher Selektionsdruck auf eine effiziente Verkleinerung des mt Genoms, gekoppelt mit einer um den Faktor 25 bis 90 erhöhten Mutationsrate (je nach Autor, z.B. (Horai et al., 1992; Allen und Raven, 1996; Pesole et al., 1999). Als Konsequenz ist das mt Genom extrem effizient mit zum Teil überlappenden Genen gepackt, und die mitochondrialen rRNAs und tRNAs sind deutlich kleiner als ihre cytosolischen Gegenstücke. Die hohe Mutationsrate findet ihren Ausdruck in einer hohen Variabilität der Sequenzen der mt tRNAs. Während die cytosolischen tRNA Sequenzen unter Säugetieren praktisch invariabel sind, sind noch keine zwei identischen mt tRNA Sequenzen aus verschiedenen Tierspezies bekannt (Helm et al., 2000). Die aus cytosolischen tRNAs bekannten typischen Tertiär- und Sekundarstrukturelemente sind in mt tRNAs teilweise durch Mutationen degradiert. Dennoch sind diese tRNAs in der Lage, mitochondriale Proteinbiosynthese aufrecht zu erhalten. Dabei ist zu berücksichtigen, dass in Mitochondrien nur dreizehn verschiedene Proteine synthetisiert werden, im Gegensatz zu vielen tausend im Cytoplasma. Diese Tatsache ist sicherlich Bestandteil des erwähnten Selektionsdrucks und erlaubt eine Spezialisierung der mitochondrialen Proteinbiosynthese, welche die involvierten Komponenten zu hochinteressanten Studienobjekten macht. Die Entdeckung der ersten humanpathogenen Mutationen (Goto et al., 1990; Shoffner et al., 1990) rückte dieses Forschungsgebiet schlagartig aus der akademischen Grundlagenforschung in die Nähe der Klinik. Heute sind über 150 pathogene Punktmutationen im human mitochondrialen Genom bekannt. Etwa die Hälfte davon liegt in mt tRNAs, von denen sich wiederum einige durch besondere Häufung verschiedener pathogener Mutationen, oder durch weit überdurchschnittliche Inzidenzen definierter Punktmutationen auszeichnen und welche daher auch als Hot Spots bezeichnet werden (Florentz und Sissler, 2001). Die zwei bekanntesten Hot Spots sind die Gene der tRNALys und der tRNALeu(UUR). Obwohl die Zuordnung von Mutation und detailliertem Krankheitsbild nicht eineindeutig ist, sind die Mutationen A8344G im Lys-Gen und A3243G im tRNALeu(UUR)-Gen in der Literatur häufig vereinfachend mit den Namen MERRF- bzw. MELAS-Mutation belegt.
Der biochemisch auffälligste Befund ist ein deutlich erhöhter Pegel von Milchsäure im Blut („lactic acidosis“) welcher bei gesunden Individuen nur nach größerer physischer Anstrengung zu sehen ist, stammt aus einer erhöhten glykolytischen Aktivität, welche die mangelnde ATP Produktion der Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung kompensieren soll. Die Symptome können unter anderem verschiedene Neuropathien, Cardiomyopathie, Diabetis und Taubheit beinhalten, welche in der Regel bereits in der Kindheit einsetzen (Übersichtsartikel von Wallace, 1999, siehe auch Thyagarajan und Byrne, 2002).

Biochemisches Umfeld der molekularen Pathogenese

Die biochemische Funktion der tRNA in der Proteinbiosynthese ist klar definiert und hervorragend erforscht. Wegen der Komplexität des Translationsapparates existiert eine Vielzahl von molekularen Wechselwirkungen, welche durch pathogene Mutationen potentiell beeinträchtigt sein und somit letztendlich zu einer Störung der Proteinbiosynthese führen könnten. Wie in Abbildung 1 illustriert, bestehen mögliche Angriffspunkte einer pathogenen Mutation bereits bei der Biosynthese der tRNA, beginnend bei der Transkription (Die MELAS Mutation 3243 liegt im Bereich eines Transkriptions-Terminations-Signales (Chomyn et al., 1992), bei der Prozessierung am 5’-Ende durch RNase P (King et al., 1992; Masucci und Schon, 1996; Puranam und Attardi, 2001) bzw. am 3’-Ende durch 3’-tRNase (Levinger et al., 2003). Ferner können vor, während, oder nach der Prozessierung bei einer Reihe von Nukleotid- und Basenmodifikationen Defekte auftreten (Helm et al., 1999b; Yasukawa et al., 2000a; Yasukawa et al., 2000b; Suzuki et al., 2002). Nach Eintritt in den Proteinbiosynthesezyklus geht die tRNA Wechselwirkungen mit Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Ef-Tu, dem Ribosom und der mRNA ein.

 

Abb.1: Wechselwirkungen im Lebenszyklus                  einer mitochondrialen tRNA

Zudem ist die mt tRNA während ihrer gesamten Existenz dem Abbau durch mitochondriale RNasen ausgesetzt. Da sie durch Wechselwirkung mit den Biopolymeren des Proteinsyntheseapparates dem Zugriff der RNasen zeitweise entzogen wird, können fehlerhafte Wechselwirkungen beschleunigte Degradation nach sich ziehen. Da tRNAs in Mitochondrien auch als Prozessierungspunkte der mitochondrientypischen großen polycystronischen mRNA dienen (Montoya et al., 1981), und einige Gene in der Regulierung der mitochondrialen Transkription involviert sind, finden sich hier zusätzliche potentielle Pfade der molekularen Pathogenese. Am besten untersucht sind die oben erwähnten Mutationen A8344G und A3243G, die ursächlich mit den MERRF und MELAS Syndromen in Zusammenhang gebracht werden.

Wie im Folgenden klar werden wird, sind die diversen Untersuchungen durchaus nicht frei von Widersprüchen und es ist recht kompliziert, ein klares Bild aus der Fülle von experimentellen Befunden zu zeichnen. Gerade für diese beiden Model-Mutationen wäre dieses jedoch sehr wichtig. Die komplette Aufklärung der molekularen Pathogenese zunächst einer der vielen tRNA-abhängigen mitochondrialen Myopathien ist wünschenswert und notwendig, um z.B. Therapiechancen überhaupt einschätzen zu können. Dies würde auch die Forschung an den mehr als 70 weiteren tRNA Mutationen deutlich weiterbringen. Als Modelsysteme bieten sich die Systeme Lysin und Leucin wegen ihrer fortgeschrittenen Erforschung an. Das hohe Interesse an diesen Systemen wird auch aus der Qualität der wissenschaftlichen Zeitschriften deutlich, in denen die entsprechenden Studien erscheinen.
Die Effekte der Mutation A8344G sind ausgiebig in Biopsien, in vivo und in vitro untersucht worden. In Patienten wird die Mutation praktisch nie rein (homoplasmisch), sondern immer nur zu einem Bruchteil (heteroplasmisch) angetroffen. Pathologische Befunde wurden erst oberhalb eines Schwellenwertes von etwa 80% Anteil mutationstragender mt DNA beobachtet. Um das Problem der Heteroplasmie zu umgehen, werden zum Studium in Zellkultur so genannte Cybrid-Zelllinien benutzt. Diese werden durch Fusion von Zellen ohne mt DNA (rho°-Zellen) mit Patientenzellen konstruiert, aus denen zuvor der Zellkern entfernt worden war (King und Attardi, 1989). Aus der Fusion resultieren Cybride mit einen identischen Hintergrund an nukleärer DNA und praktisch allen möglichen Abstufungen an Heteroplasmie. Um deutliche Effekte zu beobachten, werden in der Regel homoplasmische Zelllinien, also solche mit ausschließlich mutierter DNA bzw. mit ausschließlich Wildtyp DNA miteinander verglichen. Die frühen in vivo Untersuchungen sind in (Chomyn, 1998) kompetent zusammengefasst. Eine viel beachtete Studie aus dem Jahr 1995 zeigte in Cybriden, welche homoplasmisch die MERRF Mutation trugen, einen verminderten steady-state-level an mt tRNALys, sowie einen verminderten steady-state-level aminoacylierter mt tRNALys (Enriquez et al., 1995). Unsere Analyse der post-transkriptionellen Modifikationen in den selben Cybridzellen ergab einen leicht verringerten Anteil an mt tRNALys die an m1A9 modifiziert waren, und, sowohl für Wildtyp als auch für die Mutante eine nur etwa 30%ige Modifikation an U34 (Helm et al., 1999b). Studien mit einem anderen Satz Cybridzellen finden keinen Unterschied im steady-state-level an aminoacylierter mt tRNALys, noch verminderte Stabilität der tRNA selber, jedoch vollständige Modifikation der Wobbleposition des Anticodons U34 des Wildtyps und komplettes Fehlen der Modifikation an U34 in MERRF- tRNALys (Yasukawa et al., 2000), was in einem in vitro Translationsassay zu fehlerhafter Codon-Anticodon Erkennung und stark beeinträchtigter Proteinsynthese führte.

Bei der Betrachtung verschiedener in vivo Studien fällt auf, dass sich gelegentlich widersprüchliche Daten finden, ohne das notwendigerweise die Akkuratheit der Experimentatoren oder die Kompetenz der korrespondierenden Labors in Frage stünde. Zum Teil sind individuelle Unterschiede in den diversen verwendeten Cybrid-Zelllinien und Unterschiede in der Durchführung der Zellkultur selber die wahrscheinlichsten Gründe. Cybrid-Zelllinien mit pathogenen mt tRNA Mutationen neigen zu glykolytischem Stoffwechsel, was an einer deutlich verfrühten Verfärbung des pH Indikators in Zellkultur durch Milchsäure leicht zu erkennen ist. Der metabolische Status der Zelle, welcher auch stark vom exakten Protokoll der Zellkultur abhängt, beeinflusst unter anderem das Membranpotenial und damit grundsätzlich die Fähigkeit der Mitochondrien zum Import von Proteinen. So konnten wir zeigen, dass eine verminderte Basenmethylierung m5C48 in tRNALeu(UUR) nicht direkt durch die in der selben tRNA gelegene MELAS Mutation bedingt ist, sondern auch durch die MERRF Mutation ausgelöst werden kann, obwohl diese Mutation in einer anderen tRNA liegt (Helm et al., 1999). Vermutlich ist dieser Defekt also eher eine indirekte Folge des veränderten Metabolismus.
Diese Beobachtung deutet auf ein generelles Problem einiger Untersuchungen in vivo hin. Bei der Untersuchung pathogener Mechanismen in Zellkultur, insbesondere solcher Mechanismen, die fundamentale biologische Prozesse wie Proteinbiosynthese betreffen, ist eine saubere Unterscheidung von Ursache und Wirkung schwierig, selbst wenn mit genügend Übersicht Kontrollexperimente angesetzt wurden. Ähnliche Argumentationen erschweren die eindeutige Interpretation vieler analytischer Befunde, die mt tRNAs betreffen. Zur Klärung ausgewählter Wechselwirkungen der tRNAs mit speziellen Komponenten des Proteinbiosyntheseapparates sind Untersuchungen in vitro nötig, weil sie die Isolierung einzelner Faktoren erlauben. Referenzen zu in vitro Arbeiten einzelner tRNAs, insbesondere der Systeme Leucin und Isoleucin werden in Originalarbeiten (Florentz und Sissler, 2001; Levinger et al., 2003; Sohm et al., 2003) und im Übersichtsartikel von (Florentz et al., 2003) gegeben.